Activatable Photosensitizers and Fluorescent Probes

Abstract

광역학 치료 (photodynamic therapy, PDT)는 체내에 광민감제 (photo-sensitizer)를 주사한 후 특정 파장의 빛을 조사하여 활성 산소를 발생시킴으로써 표적 조직을 손상 및 괴사 시키는 치료법이다. PDT는 수술 없이도 국소적 부위를 효과적으로 치료할 수 있어 가장 촉망 받는 치료법 중 하나로 인식되어 광민감제의 개발 및 응용에 관한 연구가 최근 활발히 진행되고 있다. 이러한 점을 착안하여, 1 장에서는 항암 및 항균 치료를 위한 광민감제를 설계 및 합성하였다. 첫째로 악성 종양에서 과량 발현되는 효소인 cathepsin B에 의해 활성화되는 시아닌 (cyanine) 유도체 CyA-P-CyB를 합성하여 암 표적 이미징 및 광역학 치료가 가능한 다기능 물질로 이용될 수 있음을 확인하였다. 생체 외 세포 실험에서는 CyA-P-CyB가 cathepsin B에 의해 활성화되어 암 세포에서 강한 형광과 광독성 (photocytotoxicity)을 보이는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 종양 마우스 모델에서 암 표적 형광 이미징 및 항암 효과를 관찰하여 암 질환의 진단 및 치료를 동시에 수행할 수 있는 치료제임을 증명하였다, 두 번째로 아연-프탈로시아닌 (zinc (II) phthalocyanine) 기반의 나노 어셈블리를 합성하여 박테리아에 대한 광역학 치료를 시도하였다. 아연-프탈로시아닌 유도체 PcA는 별다른 제조 방법 없이 수용액에서 자기조립을 하여 균일한 나노입자 NanoPcA를 이룬다. NanoPcA는 다른 프랄로시아닌 단량체와 비교하여 우수한 활성 산소 발생 효과를 보였으며, 항생제에 내성을 보이는 슈퍼 박테리아에 우수한 항균 효과를 보였다. 이러한 항균 활성은 양전하를 띄는 NanoPcA의 표면과 음전하를 띄는 박테리아 표면과의 정전기적 인력에 기인한다. 뿐만 아니라, NanoPcA는 그람 양성균에 대해 10 나노몰의 적은 농도에서도 항균 효과를 보여, 박테리아 감염 질병을 치료하는 데에 효과적인 광역학 치료제로 사용될 수 있는 잠재성을 보여주었다. 시스테인 (cysteine, Cys), 호모시스테인 (homocysteine, Hcy), 글루타티온 (gluotathione, GSH)과 같은 바이오티올(biothiol)의 생체 내 비정상적인 수치는 간 손상, 암, 에이즈, 알츠하이머와 같은 특정 질병의 발생과 밀접한 관련이 있다. 따라서 바이오티올의 선택적인 검출은 여러 질병의 조기 진단을 위해 최근 중요한 연구 과제가 되고 있다. 이러한 점을 착안하여, 2 장에서는 생체 내 바이오티올을 높은 선택성 및 감도로 검출하는 형광 센서를 설계 및 합성하였다. 첫째로 니트로벤조티아다이아졸 (nitrobenzothiadiazole) 유도체 SNBD-1을 합성하여 Cys과 Hcy을 검출하는 프로브로 사용하였다. SNBD-1은 중성 조건 (pH 7.4)에서는 여러 아미노산 중 오직 Cys, Hcy와 선택적으로 반응하여 UV 흡광 변화 및 형광 증가를 보이는 반면, 약산성 조건 (pH 6.0)에서는 Cys만을 선택적으로 검출하는 것을 확인 하였다. 또한 세포 실험을 통하여 세포 내 존재하는 Cys, Hcy을 선택적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 두 번째로 시아닌 (cyanine) 유도체 Cy-1과 Cy-2을 합성하여 GSH를 검출하는 형광 센서로 사용하였다. Cy-1은 두 개의 시아닌 분자가 연결된 구조를 가지고 있으며, Cy-2는 비스-트리플루오로메틸벤젠티올 그룹을 가지고 있다. 두 프로브 모두 GSH에 의해 적외선 영역에서 강한 형광을 나타내며, 이를 세포 이미징 실험에서도 확인하였다. 뿐만 아니라, 종양 쥐 모델을 이용하여 생체 내 이미징 실험을 진행하였을 때, 프로브의 형광이 정상 조직보다 GSH가 더 많이 발현되는 종양 조직에서 더 강하게 나타남을 확인하였다. 세포 소기관은 세포 내에서 각자의 특수한 기능을 하기 때문에 이들의 고유한 기능과 상관관계를 이해하는 것은 다양한 질병의 원인을 규명하고 나아가 치료제를 개발하는 데에 매우 중요하다. 이를 위해 특정 세포 소기관 내의 변화 및 물질을 선택적으로 실시간 이미징할 수 있는 형광 프로브의 개발이 필요하다. 따라서 3 장에서는 특정 소기관을 검출하고 소기관 내의 특정 분자를 이미징하는 형광 프로브를 개발하였다. 첫째로 헤미시아닌 (hemicyanine) 유도체 HCA-Mito를 합성하여 미토콘드리아를 선택적으로 이미징하는 형광 프로브로 개발하였다. 양전하를 띄는 HCA-Mito는 pH의 변화에 안정적이고 낮은 세포 독성을 가지고 있으며 미토콘드리아 표적 형광 프로브로 적합하다. 뿐만 아니라, 미토콘드리아의 막 전위가 탈분극 (depolarization)되면 HCA-Mito의 형광이 급격히 감소하는 것이 관찰되어, 미토콘드리아의 기능에 영향을 끼치는 막 전위 변화도 검출할 수 있음을 증명하였다. 두 번째로 로다민 B (rhodamine-B) 유도체에 아자크라운 에테르 그룹이 도입된 RB-ACE 를 합성하여 리소좀 내의 pH 변화를 실시간으로 이미징하는 프로브로 사용하였다. RB-ACE는 산성 조건에서 수소 이온에 의해 스파이로 락탐 고리가 열리며 강한 형광을 나타낸다. RB-ACE는 높은 광안정성과 낮은 세포 독성으로 효과적으로 리소좀 내의 pH 변화를 감지한다. 뿐만 아니라, 클로로퀸 (chloroquine)에 의한 알칼리화 현상과 덱사메타손 (dexamethasone)에 의한 세포 사멸 현상을 실시간으로 모니터링 할 수 있어 생의학 정보를 제공하는 데 유용한 프로브가 될 것임을 증명하였다. 아연 이온은 신경 조절 물질로 작용하여 신경 전달에 있어서 중요한 역할을 하며, N-메틸-D-아스파테이트 (NMDA) 수용체와 같은 이온 통로들의 활성을 조절한다는 것이 알려져 있다. 따라서 신경 세포에서의 아연 이온의 기능을 심층적으로 이해하기 위해서는 시냅스 말단의 아연이온 농도의 변화를 이미징할 수 있는 프로브가 필요하다. 따라서 4 장에서는 NMDA 수용체와 강하게 결합하는 이펜프로딜 (ifenprodil) 그룹을 가지는 아세단 (Acedan, 2-acyl-6-dimethylamino-naphthalene) 유도체 1과 나프탈이미드 (naphthalimide) 유도체 2를 개발하여 NMDA 수용체를 이미징하고, 시냅스 말단에 존재하는 아연 이온을 선택적으로 검출할 수 있는 이광자 형광 프로브로 사용하였다. 프로브 1과 2의 검출 능력은 뉴런 세포 및 생체 해마 조직에서도 관찰 할 수 있었으며, 이러한 결과는 두 프로브가 신경질환과 아연 이온의 상관 관계를 연구하는 데 유용하게 사용될 수 있음을 증명하였다. 마지막 5 장에서는 벤조비스이미다졸리움 유도체인 Np-BBI를 합성하여 불소 이온을 선택적으로 검출하는 화학 센서로 개발하였다. Np-BBI는 아세토나이트릴 용액에서 불소 이온과 아세테이트 이온에 의해 강한 형광을 나타내고, 적은 양의 물이 첨가되면 불소 이온에만 선택적으로 형광이 증가함을 보였다. 시분해 분광 실험 및 밀도 범함수 이론 (Density function theory) 계산을 진행한 결과, 벤조비스이미다졸리움이 안정한 응집체를 형성하는 데에 불소이온이 중요한 역할을 하며, 이를 통해 불소 이온의 선택적 검출이 가능함을 설명할 수 있었다. 또한 물이 첨가되면 벤조비스이미다졸리움 응집체가 공간적으로 제한되어 더욱 강한 형광을 나타내는데, 이는 응집 유도 발광(Aggregation-induced emission) 현상으로 설명할 수 있었다.;In chapter I, two photosensitizers were developed as photodynamic therapy (PDT) agents for tumors and bacteria, respectively, because photosensitizers are the key substances for PDT, which is an efficient therapeutic method for cancer and other disorders. First, a cyanine derivative CyA-P-CyB activated by cathepsin B was designed and developed as a FRET-based NIR fluorescent probe and phototherapy agent for tumors. In vitro evaluations indicated that CyA-P-CyB exhibited NIR fluorescence in tumor cells via the cleavage of a peptide linker induced by cathepsin B. MTT assays showed that the CyA-P-CyB exhibited the specific phototoxicity toward tumor cells, where cathepsin B was more expressed than in normal cells. More importantly, CyA-P-CyB was also successfully applied to the in vivo imaging and phototherapy of tumors using xenograft mouse tumor model. Second, a zinc (II) phthalocyanine derivative PcA was developed as an antibacterial photosensitizer. PcA can undergo self-assembly to form the uniform nanosphere NanoPcA in aqueous solution. NanoPcA exhibited higher efficiency of reactive oxygen species generation compared to other phthalocyanine monomers. The positively charged surface of NanoPcA promotes its adhesion to surface of bacteria membrane. PcA was used to efficiently label bacteria with bright fluorescence. NanoPcA exhibited excellent photodynamic antibacterial activity toward antibiotic-resistant bacteria under laser irradiation. In addition, Gram-positive bacteria were photo-inactivated even by lower than 10 nM of NanoPcA. In chapter II, several fluorescent probes for detection of biothiols were developed since the determination of biothiols is highly required to understand their functional roles in biological systems and related diseases. First, a nitrobenzothiadiazole derivative SNBD-1 bearing aryl-thioether was synthesized and employed for selective detection of cysteine (Cys) and homocysteine (Hcy) in living cells. SNBD-1 in physiological condition (pH 7.4) exhibited significant enhancement of fluorescence in the presence of Cys and Hcy. More interestingly, only Cys give rise to green fluorescence of SNBD-1 in weak acidic condition (pH 6.0). SNBD-1 was successfully used to monitor the level of Cys and Hcy in living cells, indicating that it is helpful to understand the biological processes which are related to Cys and Hcy. Second, two cyanine derivatives Cy-1 and Cy-2 were developed and exploited to selectively detect glutathione (GSH). Probe Cy-1 contains two cyanine moieties in a single molecule and Cy-2 has a bis(trifluoromethyl)benzenethiol unit. GSH led to the significant enhancement in the NIR fluorescence of two probes with high sensitivity. Both probes successfully detected varying amounts of GSH in living cells. Importantly, in vivo fluorescence intensity of both probes was higher in tumors where GSH level is much higher than normal tissues in tumor bearing mouse. These results suggest that these probes can serve as a useful tool for GSH-targeting diagnostic imaging. In chapter III, two fluorescent probes were developed for imaging and sensing within specific organelles, since the visualization of functional changes in organelles is of great importance to deeper understanding of bioactivities at the cellular level. First, a hemicyanine derivative HCA-Mito bearing aniline moiety was synthesized and developed as a new mitochondria staining probe. HCA-Mito showed high coincidence with well-known mitochondria specific dye, MitoTracker with pH insensitivity and low cytotoxicity. More interestingly, HCA-Mito could clearly stain the fibrous structures in mitochondria. Upon the addition of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone which destroys the membrane potential of mitochondria, the fluorescence of HCA-Mito in mitochondria was significantly reduced, indicating that HCA-Mito can be employed to monitor changes in the mitochondrial membrane potential. Second, a rhodamine derivative RB-ACE was designed and explored as a fluorescent sensor for lysosomal pH. Upon the addition of H+, the fluorescence of RB-ACE increased gradually, which was induced by ring-opening of spirolactam by H+. RB-ACE exhibited excellent selectivity among different metal cations. Importantly, RB-ACE was successfully applied to monitoring pH changes in lysosomes with high photostability and low cytotoxicity. It was also used to monitor intracellular pH changes induced by chloroquine as well as dexamethasone. Therefore, RB-ACE could act as a practical tool for the visualization intracellular changes of pH in clinical applications. In chapter IV, two-photon fluorescent probes 1 and 2 for NMDA receptors of neuronal cells and synaptic Zn2+, were developed, respectively. Zn2+ acts a co-transmitter and modulates mainly postsynaptic and ionotropic receptors in neuronal cells. Thus, monitoring the dynamics of synaptic Zn2+ is highly required to understand spatiotemporal roles of Zn2+ and Zn2+-related neurodegenerative diseases. Each of these probe contains ifenprodil-like tail as a targeting unit for NMDA receptor. The probe 1 that has 2-acetyl-6-(dimethylamino)naphthalene fluorophore displayed the ability to image NMDA receptors with the high resolution. The naphthalimide-based probe 2 bears the di-2-picolylamine (DPA) as the Zn2+-binding ligand. Probe 2 can successfully detect the Zn2+ near the NMDA receptors and their dynamics in neuronal cells and hippocampal tissues. In the last chapter V, a new benzobisimidazolium derivative Np-BBI which has four naphthalene moieties, was developed for selective recognition of F–. Np-BBI in acetonitrile exhibited significant increase of fluorescence in the presence of F– and CH3CO2–, respectively. More importantly, when a small amount of water was added, the fluorescence of Np-BBI with only F– was further amplified. DFT calculation indicated that F– ions play an important role in the formation of stable aggregates with benzobisimidazolium units, which is a key step for sensing of F–. Moreover, in the presence of water, the aggregates become spatially restricted and fluorescence is further enhanced, which is usually explained as the aggregation-induced emission.