Pharmacokinetics study of NADPH oxidase (NOX) 2/4 inhibitor candidate, Ewha-2131 in rats

Abstract

Ewha-2131 was developed as an NADPH oxidase (NOX) 2/4 inhibitor candidate for various diseases related to reactive oxygen species (ROS), such as glioblastoma (GBM), degenerative brain disease, and macular degeneration. In the present study, we developed and validated the method for the analysis of Ewha-2131, generated for NOX 2/4 inhibition, by LC-MS/MS, for pharmacokinetic (PK) study of the compound in rats. Ewha-2131 and Ewha-1796 (internal standard, IS) were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (0.5 mg/mL) and extracted from rat plasma using acetonitrile (ACN). When the Ewha-2131 and IS were chromatographed with ACN and distilled water (DW) containing 0.1% formic acid by the ZORBAX SB-C18 column using gradient elution in LC-MS/MS, the analyte and IS peaks were eluted at 4.415 min and 4.198 min, respectively, without the intrusive peak. The concentration ranges from 0.2 to 50 ng/mL and 20 to 5000 ng/mL of Ewha -2131 were linear at the calibration curve. All the values of intra- and inter-day accuracy and precision were satisfactory and within acceptable limits of FDA guidelines. Thereafter, the rat plasma sample collected after the PK study was analyzed by the validated LC-MS/MS analysis method to detect the concentrations of Ewha-2131 at different time points. Ewha-2131 dissolved in DMSO formulation (DMSO, Tween® 80, 0.9% normal saline (1:1:8, v/v/v)) was injected intravenously (IV) (2 mg/kg) or administered orally (5, 10 and 20 mg/kg) to rats. The candidate substance's acute toxicity was monitored for 14 days following a single tail vein injection or oral dosing. In conclusion, the LC-MS/MS analysis method of Ewha-2131, a novel NOX 2/4 inhibitor candidate was developed and validated. The analytical method was applied for the pharmacokinetic study of Ewha-2131 in rats. This study helped to understand the PK profiles of Ewha-2131 by LC-MS/MS analysis, as well as the approximate lethal dose (LD) via a single toxicity test. ;Ewha-2131은 여러 자극에 의해 과도하게 활성화되면 반응성 활성산소종을 과도하게 생성하고 산화스트레스를 유발해 교모세포종, 퇴행성 뇌질환, 황반변성 등 다양한 질병을 유발하는 7개의 NOX 효소 중 NOX 2/4를 억제하는 후보 물질로 개발되었다. 본 연구에서는 새로 개발된 Ewha-2131의 약동학적 파라미터를 확인하고자 고감도 분석기기인 LC-MS/MS을 이용해 분석법을 개발하고 검증하였다. 또한, 이 물질을 마우스의 꼬리정맥으로 단 회 투여하여 용량에 따라 어떠한 독성이 나타나는지를 확인하고자 하였다. 쥐의 혈장에서 Ewha-2131를 정량하기 위해 Ewha-2131과 내부표준물질인 Ewha-1796을 순서대로 첨가한 뒤 단백질 추출용매인 아세토니트릴을 사용하여 한번에 추출하였다. 쥐의 혈장 중 약물 농도 분석을 위해 분석 기기와 컬럼은 LC-MS/MS와 ZORBAX SB-C18 컬럼(2.1 mm x 50 mm, 1.8 μm, Agilent, USA)을 이용하였으며, 아세토나이트릴(0.1% 포름산 첨가)-증류수(0.1% 포름산 첨가) 이동상 조건에서 유속 0.25 mL/min으로 그래디언트 용출법을 이용하여 분석하였을 때, Ewha-2131과 내부표준물질의 유지시간은 각각 4.415분과 4.198분으로 확인되었고, 이 분석조건에서 두 물질 모두 기타 혈장 성분들과 잘 분리되었다. Ewha-2131의 검량선은 0.2~50 ng/mL, 20~5000 ng/mL의 저, 고농도 범위에서 양호한 직선성을 나타냈으며, 일내 및 일간 정확도와 정밀도의 모든 값은 FDA에서 제시하는 허용 가능한 한도 내에 있음을 확인해 본 분석법이 쥐 혈장 중 Ewha-2131을 정량하는데 충분한 감도, 정확도 및 정밀도를 갖고 있음을 보여주었다. 이와 같이 검증된 LC-MS/MS 분석법은 DMSO 제형(DMSO, Tween® 80, 0.9% 생리식염수(1:1:8, v/v/v))으로 제조한 Ewha-2131을 정맥과 경구로 투여한 후 시간 별로 채취한 쥐 혈장 샘플을 분석하는데 적용되어 혈장 중 약물 농도의 경시적 변화를 바탕으로 약동학적 파라미터들을 도출할 수 있었다. Ewha-2131의 경구 투여 용량을 5 mg/kg에서 20 mg/kg까지 증가시켰을 때 절대 생체이용률은 용량 의존적으로 증가하였으나, 소실 반감기, 겉보기 분포 용적, 경구 클리어런스는 용량 별로 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한, Ewha-2131의 독성을 확인하고자 이를 꼬리 정맥과 경구로 단 회 투여한 후 14일간 모니터링하였다. 꼬리 정맥 투여군의 경우, 고농도인 10 mg/kg에서 성별에 상관없이 실험에 사용한 5마리 모두 사망하였으며, 중간 농도인 5 mg/kg와 저 농도인 2 mg/kg에선 독성이 관찰되지 않았다. 경구 투여군의 경우, 모든 농도에서 독성이 관찰되지 않았다. 결론적으로 본 연구에서는 새롭게 개발된 NOX 2/4 억제제 후보물질인 Ewha-2131의 LC-MS/MS 분석법을 개발 및 검증하였고, 검증된 분석법은 Ewha-2131의 약동학적 연구에 적용하여 LC-MS/MS 분석을 통한 Ewha-2131의 PK 프로파일 확인과 단 회 독성시험을 통한 대략적인 치사량(LD)을 확인하는 것이 가능하였다.