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Abstract

Solute carrier family 5 member 8 (SLC5A8) 수송체는 위장관, 신장, 갑상선, 뇌, 망막 등 체내의 다양한 기관에서 발현한다. 이 수송체는 단쇄지방산 (short chain fatty acids)과 벤조에이드와 같은 모노카르복실레이트 약물을 흡수한다. SLC5A8 유전자는 대장암에서의 종양 억제 유전자로 알려졌다. 대장암에서 SLC5A8 수송체는 DNA 메틸화에 의해 발현이 억제되지만, SLC5A8 수송체의 이소성 발현은 장내세균에 의해 생성되는 부티레이트, 프로피오네이트, 피루베이트를 흡수한다. 흡수된 세 물질은 histone deacetylase (HDAC)의 활성을 억제하여 암세포의 세포 주기를 정지시키고, 세포 증식을 억제한다. 이와 독립적으로 SLC5A8 수송체는 서바이빈의 전사와 핵 내부로의 이동을 억제하여 암세포의 진행을 억제한다. SLC5A8 유전자의 종양 억제 유전자로서의 중요성이 강조되어 왔지만, SLC5A8 유전자 변이가 SLC5A8 수송체 발현에 미치는 영향과 각 변이 유전자가 암에 미치는 영향에 대한 연구는 보고된 바 없다. 본 연구에서는 SLC5A8 유전자 변이가 수송체의 발현에 미치는 영향과 그에 따른 대장암 세포의 증식과 이동의 변화를 in vitro 실험을 통해 알아보았다. 먼저, NCBI, dbSNP의 SNP 데이터를 이용하여 SLC5A8 missense SNP 중 minor allele의 빈도가 5% 이상인 흔한 변이형을 확인하였고, 1,000 Genomes Project 유전자형 데이터를 바탕으로 일배체형을 구성하였다. 이어서 DLD-1과 HCT-116 세포에 SLC5A8 wild type 또는 변이 유전자를 형질주입 시켜 SLC5A8 wild type 또는 변이 유전자를 과발현하는 세포주를 제작하였다. 이후 biotinylation과 immunoblotting을 통해 SLC5A8 유전자 변이에 따른 수송체 발현 차이를 확인하였다. 그런 다음, SLC5A8 wild type 또는 변이 유전자를 과발현하는 세포에 프로테아좀 억제제인 MG132와 리소좀 억제제인 bafilomycin A1을 처리하여 SLC5A8 변이 유전자에 의한 단백질 folding 또는 trafficking defect를 확인하였다. 또한 colony formation assay을 통해 SLC5A8 유전자 변이가 대장암 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 마지막으로, wound healing assay를 이용하여 SLC5A8 유전자 변이에 따른 대장암 세포의 이동을 확인하였다. African, American, East Asian, European 4개의 주 인종 그룹에서 SLC5A8 missense SNP 중 흔한 변이형 2개와 4개의 일배체형이 확인되었다. 이 중, 2개의 변이 유전자와 wild type인 일배체형 1 (H1), 그리고 4개의 인종 그룹 모두에서 높은 빈도를 보인 일배체형 2 (H2)에 대해 분자세포생물학 실험을 수행하였다. 그 결과, Val193Ile 변이는 대장암에서의 SLC5A8 수송체의 발현을 wild type에 비해 유의하게 감소시켰고, Met490Ile 변이는 wild type에 비해 단백질 발현을 증가시킨 것으로 보이나 통계적으로 유의하지 않았다. 두 변이를 모두 갖고 있는 일배체형 H2는 단백질 발현을 유의하게 감소시켰다. Val193Ile 변이와 H2에 의해 감소된 SLC5A8 발현은 MG132와 bafilomycin A1에 의해 회복되었다. Colony formation assay 결과, Val193Ile 변이는 대장암 세포의 증식을 유의하게 증가시켰으나, Met490Ile 변이는 유의하게 감소시켰다. H2는 대장암 세포의 증식을 유의하게 증가시켰으나, Val193Ile 변이에 비해서는 적은 증식을 보였다. 이와 유사하게 wound healing assay에서 Val193Ile 변이는 대장암의 세포를 유의하게 증가시켰고, Met490Ile 변이의 세포의 이동은 유의하게 감소시켰다. H2는 세포의 이동을 유의하게 증가시켰으나, Val193Ile 변이에 비해 적은 이동을 보였다. 본 연구에서는 대장암에서 SLC5A8 유전자 변이가 세포막에서의 SLC5A8 수송체 발현에 유의한 영향을 주는 것을 확인하였다. 또한 이러한 SLC5A8 수송체 발현의 차이는 대장암의 증식과 이동에 영향을 준다는 것을 밝혔다. SLC5A8 유전자 변이가 대장암의 발생 및 진행과 연관이 있는 것으로 보이나, SLC5A8 유전자 변이의 임상적 의의를 도출하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하겠다.;Solute carrier family 5 member 8 (SLC5A8) transporter is expressed in various organs in humans, including the gastrointestinal tract, kidney, thyroid gland, brain, and retina. SLC5A8 mediates the absorption of short-chain fatty acids and various monocarboxylic drugs including benzoate. SLC5A8 was identified as a candidate tumor suppressor gene in colorectal cancer. SLC5A8 is silenced by DNA methylation in colorectal cancer. However, ectopic expression of the SLC5A8 transporter in colorectal cancer leads to the uptake of butyrate, propionate, and pyruvate produced by bacteria. These compounds suppress histone deacetylase (HDAC) to stop the cell cycle and inhibit cell proliferation. Independent of HDAC inhibition, SLC5A8 suppresses cancer progression by inhibiting the translocation of survivin anti-apoptotic protein by decreasing the phosphorylation of STAT3. Although the importance of SLC5A8 as a tumor suppressor gene has been emphasized, only a few studies have investigated the effect of SLC5A8 variants on the expression of the SLC5A8 transporter and the function of each SLC5A8 variant in colorectal cancer. This study aimed to identify and functionally characterize SLC5A8 variants using in vitro assays. Common variants (minor allele frequency ≥ 5%) among SLC5A8 missense single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified using SNP data from the NCBI dbSNP. Haplotypes were assembled using genotype data from the 1,000 Genomes Project. Next, stable cell lines expressing SLC5A8 were generated after transfection of vectors containing SLC5A8 wild type or its variant into the DLD-1 and HCT-116 human colorectal cancer cell lines. SLC5A8 expression in the plasma membrane was measured by cell surface biotinylation and immunoblotting using those cells. Proteins with folding or trafficking defects by SLC5A8 variants were identified by treatment with an inhibitor of proteasomal proteolysis, MG132, and an inhibitor of lysosomal degradation, bafilomycin A1. The effect of SLC5A8 variants on the proliferation of colorectal cancer cells was measured using a colony formation assay. Finally, the migration of colorectal cancer cells according to SLC5A8 variants was identified using a wound healing assay. Two common variants and four haplotypes were identified in African, American, East Asian, and European ethnic groups. Among them, two variants (Val193Ile and Met490Ile), wild type haplotype 1 (H1), and haplotype 2 (H2), which had a high frequency in the four ethnic groups, were selected for molecular cell biology experiments. Val193Ile showed significantly decreased expression of SLC5A8 on the plasma membrane compared to that of the wild type. Expression of Met490Ile was increased, although not statistically significantly. H2 significantly reduced SLC5A8 expression. The SLC5A8 expression of Val193Ile and H2 were significantly recovered of naïve wild type of SLC5A8 expression after treatment with MG132 and bafilomycin A1. In the colony formation assay, Val193Ile and H2 showed significantly increased proliferation of DLD-1 and HCT-116 cells, and Met490Ile reduced proliferation, compared to that of the wild type. Similarly, the wound healing assay showed that the migration of DLD-1 and HCT-116 cells expressing Val193Ile and H2 was significantly increased compared to that of the wild type, while that of Met490Ile was decreased. This study reveals that variants of SLC5A8 affect the expression of SLC5A8 on the plasma membrane and regulate the proliferation and migration of colorectal cancer cells. Further studies are necessary to investigate the clinical significance of SLC5A8 variants associated with the development and progression of colorectal cancer.