A novel A2aAR antagonist as an effective therapeutic agent for NASH

Abstract

비알콜성 지방간질환은 알코올 섭취와는 무관하게 고지방 식이나 운동 부족 등 잘못된 생활습관으로 인해 단순한 지방간에서부터 지방간염, 간 경변, 간암에 이르기까지 다양한 병변을 일으키는 질환 군이고, 간 경변과 간암 단계에 이르면 전 단계로 병변을 되돌릴 수는 없지만 그만큼 사망 가능성은 더 높아지기 때문에 매우 위험한 질병이다. 이 중에서도 비알코올성 지방간질환의 치사율을 높이는 주요 증상인 간 섬유증을 동반하는 비알코올성 지방간염 단계가 비알코올성 지방간질환의 치료를 위해 주로 연구되고 있다. 비알코올성 지방간염은 높은 치사율과 더불어 전세계적으로 유병률이 높은 편이지만 발병 기전 자체가 매우 복잡해서 아직까지 이 질환에 특이적으로 작용하는 치료제는 개발되지 않았다. 그렇기 때문에 비알코올성 지방간염 치료제의 개발이 필요한 실정이다. 간 섬유화는 간 손상이 발생했을 때 간 내에서 간 세포를 보호하려는 작용의 일종으로 세포 외 기질이 과도하게 분비되기 때문에 간 조직이 점점 굳는 질환이다. 간의 여러 세포 중에서도 간성상 세포가 주로 활성화되어서 간 섬유화를 영구화시키는 세포 내의 여러 작용들을 유도하기 때문에 간 섬유화 치료 측면에 있어서 간성상 세포가 주로 연구되고 있다. 간 손상이 발생했을 때 간 내에서 세포 외 아데노신의 농도가 과도하게 증가함에 따라 간성상 세포막에 걸쳐서 존재하는 아데노신 수용체 2A 의 활성화가 유도되기 때문에 세포 외 기질인 콜라겐 등의 생성이 증가되어 간 섬유증이 유도되었다는 이전의 연구가 그 예시 중 하나이다. 아데노신 수용체는 G 단백질 결합 수용체 중 한 종류이고, 각각 결합되어 있는, 서로 다른 종류의 G 단백질을 통해 그 하위의 신호전달 경로를 활성화시켜서 세포 내에서 여러 작용을 유도한다. 이러한 이전의 연구 결과들을 기반으로 해서 활성화되었을 때 간 섬유화를 유도하는 아데노신 수용체 2A 의 기능을 억제하는 길항제를 발굴해 비알코올성 지방간염에 대한 새로운 치료제를 개발하고자 했다. 먼저 아데노신 수용체 2A 와 간 섬유증의 상관관계를 확인하기 위해 인간 간성상 세포주인 LX-2 를 활성화 시켰더니 간 섬유화를 유발하는 collagen, fibronectin 과 아데노신 수용체 2A 신호전달 경로에 존재하는 인자들의 단백질 발현이 증가한 것을 확인했다. 이러한 경향은 아데노신 수용체 2A 를 과도하게 발현하는 LX-2 에서도 유사한 것을 통해 간의 손상을 모방한 상태에서 간성상 세포와 그 세포막에 존재하는 아데노신 수용체 2A 의 활성이 증가되어 결국 간 섬유화가 유도됨을 알 수 있었다. 아데노신 수용체 2A 의 활성을 저해하는 길항제인 ZM241385 를 활성화된 LX-2 에 처리했더니 섬유화 유도 인자들의 단백질 발현이 감소했고, 아데노신 수용체 2A 의 신호전달 경로의 하위 인자들의 활성도 감소한 결과를 통해 아데노신 수용체 2A 의 신호전달경로가 억제되어 항섬유화 효과가 나타남을 확인할 수 있었다. LX-2 에 길항제를 처리했을 때 항섬유화 효과가 나타나는 것을 확인했기 때문에 아데닌 유도체로 합성된 21 종의 화합물 중 간섬유증을 가장 잘 완화할 수 있는, 효과적인 아데노신 수용체 2A 의 길항제로 작용할 화합물을 찾는 스크리닝을 진행했다. 그 중 화합물 11 번이 섬유화를 유도하는 마커들과 간성상 세포 활성화 마커의 발현을 유의미하게 감소시켰다. 아데노신 수용체 2A 의 신호전달 경로 인자들의 활성도 화합물 11 번 처리시에 가장 잘 감소하는 경향을 보였다. 11 번의 이러한 강력한 항섬유화 효과와 아데노신 수용체 2A 로써의 역할은 비알코올성 지방간 동물 모델을 이용한 실험에서도 확인되었다.;Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) ranges from simple steatosis to cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). As steatosis becomes severe enough to cause inflammation in liver, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is developed, and it makes mortality rate higher when liver fibrosis is accompanied. Despite of its fatality, there are no currently available medicines for NASH/liver fibrosis yet, due to its complicated pathogenesis mechanisms. Therefore, novel therapeutic agents specific for NASH are urgently needed. Among various liver cells, hepatic stellate cells (HSCs) are the most correlated with liver fibrosis. When the liver is damaged, cytokines and growth factors are released from hepatic cells and this circumstance makes HSCs be activated. Activated HSCs initiate and perpetuate fibrogenesis inducing phenomena such as proliferation of hepatic cells or accumulation of ECMs. Then connective tissues are excessively developed and liver shows the pathologic features of liver fibrosis. I focused on adenosine A2A receptor (A2aAR) to discover effective strategy for NASH/liver fibrosis. When liver is fibrotic, extracellular ATP is released excessively from various hepatic cells and converted into adenosine, which activates adenosine receptors, especially A2aAR in HSCs. It induces liver fibrosis by expressing profibrotic genes in its downstream signaling pathway. LX-2 cells overexpressing A2aAR, a human hepatic stellate cell line, showed the upregulated protein expression of profibrotic markers and A2aAR downstream factors in western blotting. This pattern was similar when LX-2 cells were activated. Reversely, the selective A2aAR antagonist ZM241385 lowered protein expressions of profibrotic markers as well as inhibiting A2aAR downstream signaling pathway. These results suggest that A2aAR antagonists have antifibrotic effect. In order to develop a new treatment for NASH that acts as an A2aAR antagonist, I screened the A2aAR inhibitory effect of newly synthesized 21 adenine derivatives provided by Professor Ryu’s group. Among compounds, RAD 11 notably decreased protein expression of profibrotic makers and HSC activation marker. Since A2aAR activates its downstream AC/cAMP/PKA/CREB pathway, I also evaluated CRE promoter activity and cAMP concentration, which were the most decreased by RAD 11. Potent antifibrotic effect of RAD 11 was confirmed again in murine NASH model in vivo.