A novel adaptor protein, ARAP, plays a role in the activation and differentiation of T helper cells by LPS-activated dendritic cell

Abstract

A novel cytosolic adaptor protein was identified during T-cell-receptor (TCR)-mediated signaling study in our laboratory. It was named as ARAP (activation-dependent, raft-recruited ADAP-like phosphoprotein) because of similarities in structure and functions with a well-known adaptor protein, ADAP (adhesion and degranulation promoting adaptor protein). ARAP is expressed broadly in various tissues and hematopoietic cells including dendritic cells (DCs). Previous studies in our laboratory showed that ARAP plays a role in DC functions in response to bacteria lipopolysaccharide (LPS): LPS-stimulated increase in the expression of major histocompatibility complex (MHC) Ⅱ and in the secretion of interleukin (IL) 12 was significantly reduced in bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ARAP-gene knock-out (KO) mice compared with that in BMDCs from wild type (WT) mice. In this study, the reduction of MHCⅡ expression and IL-12 production in LPS-activated KO BMDCs was confirmed at transcriptional and translational levels. Transcriptional reduction of key regulatory proteins for the expression of MHCⅡ and IL-12, classⅡ transactivator (CⅡTA) and nuclear factor κB (NF- κB), was also shown in LPS-activated KO BMDCs. To demonstrate whether these differences in LPS-activated WT and KO BMDCs affect DC-mediated CD4+ T helper (Th) cell functions, further studies were carried out using OT-Ⅱ T cells with ovalbumin (OVA)-peptide-specific TCR and BMDCs stimulated with OVA-peptide and LPS. During antigen presentation to CD4+ OT-Ⅱ T cells by WT or KO BMDCs through MHCⅡ complexed with OVA-peptide, KO BMDCs resulted in significant reduction in the formation of DC-T cell conjugates and in the expression of early T cell activation marker, CD69 as compared to WT BMDCs. Moreover, T cells were differentiated into IFN-γ-secreting Th1 subtype, when WT or KO BMDCs stimulated with OVA-peptide and LPS were cultured together with CD4+ OT-Ⅱ T cells. The level of Th1 differentiation analyzed by cell population and secreted IFN-γ was also significantly reduced in the culture with KO BMDCs. This reduction in Th1 differentiation was also shown, when CD4+ OT-Ⅱ T cells, which were activated in vitro with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, were incubated with culture supernatant of KO BMDCs. Overall, these results suggest that ARAP plays a role in the function of LPS-activated DCs, activation of CD4+ T cells and induction of Th1 differentiation, through increased expression of MHCⅡ and increased production of IL-12, respectively. ;T 세포 수용체 (TCR) 매개 신호 전달 연구 과정에서 신규 어댑터 단백질을 규명하였고 염기서열 및 구조가 잘 알려진 어댑터 단백질 ADAP (adhesion and degranulation promoting adaptor protein)과 유사함을 확인하였다. 따라서 신규 어댑터 단백질을 ARAP (activation-dependent, raft-recruited ADAP-like phosphoprotein)으로 명명하였다. ARAP은 다양한 조직 및 수지상 세포 (DC)를 포함하는 조혈 세포들에서 광범위하게 발현된다. 이전 연구에서 ARAP이 박테리아 지질다당류 (LPS)에 의한 DC 활성화 과정에 관여함을 확인하였다. 즉, 야생형 (WT) 마우스와 ARAP 유전자 결손 (KO) 마우스의 골수 유래 수지상 세포 (BMDC)를 이용한 연구에서 LPS에 의한 주 조직 적합성 복합체 (MHC) Ⅱ 발현 증가와 IL-12 분비 증가가 WT마우스의 BMDC와 비교했을 때 KO 마우스에서 유의하게 감소하였다. 본 연구에서는 LPS로 활성화된 KO BMDC의 MHCⅡ 발현 및 IL-12 생성 감소를 전사 및 번역 수준에서 확인하였다. 또한, MHCⅡ 및 IL-12 발현의 주요 조절 단백질인 classⅡ transactivator (CⅡTA) 및 핵 인자 κB (NF-κB)의 전사 감소도 LPS로 활성화된 KO BMDC에서 확인되었다. LPS로 활성화된 WT과 KO BMDC의 이러한 차이가 DC 매개 CD4+ T 도움 세포 기능에 영향을 미치는지를 입증하기 위해, OVA-펩티드 특이적 TCR을 가진 OT-Ⅱ T 세포와 OVA-펩티드 및 LPS로 자극된 BMDC를 사용하여 추가 연구를 진행하였다. WT 또는 KO BMDC가 OVA-펩티드와 결합된 MHCⅡ를 통해 CD4+ OT-Ⅱ T 세포에 항원을 제시할 때, WT BMDC와 비교하여 KO BMDC는 DC-T 세포 접합체 형성 및 초기 T 세포 활성화 마커인 CD69의 발현을 현저하게 감소시켰다. 또한, OVA-펩티드 및 LPS로 자극시킨 WT 또는 KO BMDC와 CD4+ OT-Ⅱ T 세포를 함께 배양했을 때, T 세포는 IFN-γ를 분비하는 Th1 아형으로 분화하였다. 세포 집단 및 분비된 IFN-γ에 의해 분석된 Th1 분화 수준 또한 KO BMDC를 사용한 배양에서 유의성 있게 감소되었다. 이러한 Th1 분화의 감소는 in vitro에서 항-CD3 및 항-CD28 항체를 이용하여 활성화시킨 CD4+ OT-Ⅱ T 세포를 KO BMDC의 배양 상등액과 함께 배양했을 때에도 나타났다. 전반적으로, 이러한 결과들은 LPS에 의해 활성화된 DC에서 MHCⅡ 발현 증가 및 IL-12 생성 증가가 유도되어, 그 결과로 CD4+ T 세포의 활성화와 Th1 분화를 조절하는 DC의 기능에 신규 어댑터 단백질 ARAP이 관여함을 시사한다.