Circulating metabolomic and lipidomic signatures in nonobese and obese subjects with nonalcoholic fatty liver disease

Abstract

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is progressive disease from simple steatosis to nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and hepatocellular carcinoma (HCC). Although NAFLD was strongly associated with obesity and metabolic syndrome, NAFLD can affect nonobese subjects as well as obese subjects. However, the knowledge regarding mechanism underlying nonobese nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is still very limited. Moreover, the lack of relevant noninvasive biomarkers precludes early recognition of subjects at risk for development and progression of nonobese NAFLD. Therefore, the metabolic alterations associated with nonobese and obese NAFLD were investigated using metabolomic and lipidomic approaches by performing liquid chromatography-mass spectrometry. Subjects were stratified by histological severity of NAFLD (no-NAFLD, NAFL, and NASH) and 25 kg/m2 of body mass index (BMI; nonobese and obese) [nonobese no-NAFLD; nonobese NAFL; nonobese NASH; obese no-NAFLD; obese NAFL; obese NASH], and their sera were used for polar and lipid metabolite profiling. In global polar metabolite profiling, the most striking changes according to NAFLD severity were detected in bile acids (BAs). Targeted BA analysis demonstrated that unconjugated primary BAs increased only in nonobese NASH, while glyco-/tauro-conjugated primary BAs were increased both in nonobese and obese NASH. These characteristic alterations of primary BAs were maintained regardless of diabetes status and were also repeated in the independent validation cohort. Increased hepatic expression of CYP8B1 and decreased fecal expression of choloylglycine hydrolase were confirmed in nonobese NASH patients compared to nonobese NAFL patients. These results suggested that BA metabolism is dysregulated with worsening the histological severity of NAFLD in a different way between nonobese and obese subjects. Global lipid metabolite profiling analysis showed that nonobese and obese NAFLD subjects exhibit unique circulating lipidomic signatures including diacylglycerol (DAG), triacylglycerol (TAG), and sphingomyelin (SM). Saturated SMs were significantly associated with metabolic risk factors and liver histology in nonobese NAFLD. Distinctively altered patterns of DAG, TAG, and SM levels depending on the histological severity of NAFLD were confirmed in the independent validation cohort. Best lipid combinations were selected to predict NAFLD and NASH, and these lipid combinations showed good diagnostic performance for both nonobese and obese subjects. These results suggested that alterations in circulating SM, DAG, and TAG species can be differentially associated with the presence and histological severity of NAFLD in nonobese and obese subjects. Moreover, lipid metabolite combinations are expected to be useful for the differential diagnosis of NAFLD from no-NAFLD and NASH from NAFL, regardless of the obesity status. In summary, metabolomic and lipidomic profiling in sera acquired from nonobese and obese subjects with NAFLD were preformed to discover biomarkers and investigate the differences according to obesity status in NAFLD. This study demonstrated that the altered lipid and BA metabolism in the liver and gut may be related to the NAFLD progression via a different mechanism depending on obesity status.;비알콜성 지방간 질환(NAFLD)은 단순 지방증에서 비알콜성 지방간염(NASH)과 간세포암으로 진행되는 질환이다. NAFLD는 비만 및 대사증후군과 밀접하게 연관되어 있음에도 불구하고, 비만한 그룹들뿐만 아니라 비만하지 않은 그룹들도 NAFLD 영향을 받고 있다. 그러나, 비만하지 않은 그룹에서의 NASH에 대한 근본적인 메커니즘에 관한 연구는 아직도 매우 제한적으로 제시되고 있다. 또한, NAFLD에서 적절한 비침습적인 바이오마커의 부재는 질환 발생과 진행 위험의 초기 진단을 어렵게 한다. 따라서, 비만한 그룹과 비만하지 않은 그룹에서 NAFLD 진행과 연관된 대사체 변화에 대하여 대사체학과 지질체학 방법을 사용하여 연구하였다. 연구에 사용된 샘플들은 NAFLD의 조직학적 진행 정도 [비알콜성 지방간 질환을 가지지 않은 그룹(no-NAFLD), 단순 지방증 그룹(NAFL), 비알콜성 지방간염 그룹(NASH)]과 BMI 25 kg/m2 기준 [비만하지 않은 그룹(nonobese)와 비만한 그룹(obese)]에 따라 6개의 그룹으로 분류되었고 [nonobese no-NAFLD; nonobese NAFL; nonobese NASH; obese no-NAFLD; obese NAFL; obese NASH], 혈액 샘플을 사용하여 수용성 및 지질 대사체 프로파일링을 수행하였다. 수용성 대사체 프로파일링에서 NAFLD 진행 정도에 따른 가장 중요한 변화는 담즙산(BA)으로 확인되었다. 이후 수행된 BA 정량 분석에서 unconjugated primary BA는 오직 nonobese NASH 그룹에서만 증가하였고, glyco-/taruro-conjugated primary BA는 nonobese와 obese NASH 그룹 둘 다에서 증가하였음을 확인하였다. 이러한 primary BA에서 확인된 특징적인 변화들은 당뇨 여부와 상관없이 유지되었을 뿐만 아니라 독립적인 검증 코호트에서도 재현되었다. 또한, 간에서의 CYP8B1 발현 증가와 대변의 choloylglycine hydrolase 발현 감소가 nonobese NAFL 환자 대비 nonobese NASH 환자에서 확인되었다. 이러한 결과들은 NAFLD이 진행됨에 따라 nonobese와 obese 그룹들에서 서로 다른 방식으로 BA metabolism 조절에 문제가 생겼을 가능성을 보여준다. 지질 대사체 프로파일링 분석은 nonobese와 obese NAFLD 그룹들에서 diacylglycerol (DAG), triacylglycerol (TAG), sphingomyelin (SM)과 같은 독특한 혈액 내 지질 대사체 특징들을 드러냈다. 포화된 SM들은 nonobese NAFLD 그룹에서 대사적인 위험 요소나 간 조직학적 변화와 유의적으로 연관되었다. NAFLD의 진행에 따라 특징적으로 변화한 DAG, TAG, SM는 독립적인 검증 코호트에서도 확인되었다. NAFLD 또는 NASH 그룹을 예측하기 위해 최적의 지질 조합들을 선택하였고, 이러한 지질 조합들은 nonobese와 obese 그룹 둘 다에서 훌륭한 진단 성능을 보여주었다. 이러한 혈액 내 SM, DAG, TAG의 변화는 nonobese와 obese 그룹들에서 NAFLD의 발생이나 진행과 서로 다르게 연관되었을 가능성을 보여주었다. 따라서, 지질 대사체 조합들이 비만 여부와 관계없이 no-NAFLD 그룹으로부터 NAFLD 그룹을 또는 NAFL 그룹에서 NASH 그룹을 구분하는데 유용할 것으로 기대된다. 요약하면, NAFLD 질환에서 비만 여부에 따른 차이를 확인하고 또한 NAFLD 질환을 예측하기 위한 바이오마커를 발굴하기 위해 nonobese와 obese 그룹들의 혈액 샘플들에서 혈액 대사체 및 지질체 프로파일링이 수행되었다. 이 연구는 간과 소화관에서 변화한 지질과 담즙산 metabolism이 비만 여부에 따라 다른 mechanism을 통해 NAFLD 진행에 관련되었을 가능성을 제안하였다.