Structural and Functional Studies on Redox Regulation of Redox Sensitive Proteins by Proteomic Analysis

Abstract

활성산소종은 여러가지 세포활동을 조절하는데 필수적인 분자이다. 활성산소종은 암, 당뇨, 퇴행성 뇌질환을 포함한 많은 다양한 질병과에 관련되어 있지만 아직 활성산소종의 표적단백질과 그 작용이 명확하게 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 유방암세포에서 활성산소종에 민감하게 작용하는 표적단백질을 밝히고 그 단백질들이 활성산소종에 의해서 어떻게 조절되는지에 대해 연구하였다. 몸속 생체내에서 활성산소종이 발생하는 상황을 모방하기 위하여 세포에 과산화수소를 처리한 후 세포 내에 76개의 단백질들이 유의미한 변화를 나타내는 것을 확인하였고, 활성산소의 표적단백질들임을 밝혔으며, 다양한 산화적 해독후 변형이 일어나는 것을 nanoUPLC-q-TOF 질량분석기로 확인하였다. 그 중 산화스트레스에 의해 Prxs(Peroxiredoxins), DJ-1, UCH-L3, Rla0 단백질의 pI가 변화하고, 또한 이 단백질들은 쉽게 산화되어, 산화된 단백질은 프로테아좀과 오토파지 두 가지 경로로 분해되는 것을 확인하였다. 활성산소종이 단백질에 미치는 영향이 어떻게 조절되는지 확인해보기 위하여 가장 민감하게 변화하는 Prx2와 DJ-1의 구조적인 변화를 분자수준에서 연구하였다. Prx2는 잘 알려진 항산화단백질로 알려져 있다. 활성산소종이 Prx2 단백질에 일으키는 구조적인 변화를 수소/중수소 치환법에 기반한 질량분석기로 분석한 결과 Prx2의 아미노 말단 부분이 표면으로 노출되는 것을 확인하였고, 이 부분에 있는 Lysine 191 잔기에 유비퀴틴 단백질이 여러 개 붙게 되어 쉽게 프로테아좀과 오토파지로 분해되는 것을 확인하였다. 따라서 활성산소종의 표적단백질 중 하나인 Prx2가 산화 스트레스로 인해 구조가 변하고, 변한 구조로 인해 쉽게 분해되는 매커니즘을 규명하였다. DJ-1은 퇴행성 뇌질환인 파킨슨병과 연관성이 관련되어 잘 알려져 있고 항산화제를 포함하여 여러 가지 기능을 가진 단백질이다. 이 단백질의 Cys 106번 잔기가 가장 반응성이 높다고 보고되어 있는데, 이 연구에서는, NPSB 화합물을 이용하여 DJ-1이 가지고 있는 3개의 Cys 잔기 중에서 Cys 46번 잔기가 가장 활성산소종에 에 의한 반응성이 높다는 것을 밝혔다. 이를 통해 DJ-1의 3개 Cys이 모두 중요하다고 생각되어 산화 스트레스에 의한 단백질의 Cys 잔기에 해독후 변형을 자세히 확인하였다. 먼저 3개의 Cys 잔기들을 alanine으로 치환시킨 돌연변이(C46A, C53A, C106A)들을 이용하여 질량분석기로 산화적 해독후 변형을 살펴본 결과 각각의 Cys 잔기들의 상태가 서로서로 영향을 주고 받는 것을 확인하였다. 또한 DJ-1 단백질에 분자내 결합이 존재하는 것을 확인하였고, DBond 알고리즘을 접목시킨 nanoUPLC-q-TOF 이중 질량분석법을 이용한 펩타이드 분석법을 이용해 분자내 결합이 Cys46-Cys53 사이의 결합임을 밝혔다. 다음과 같은 결합이 DJ-1에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 Cys46을 Alanine으로 치환시켜 분자내 결합을 형성하지 못하는 DJ-1의 구조를 수소/중수소 치환법을 분석하였다. 그 한 결과, C46A 돌연변이 단백질은 본래의 구조를 유지하지 못하는 것을 확인하였다. 또한 변이체는 DJ-1의 기능을 하지 못하였고 DJ-1과 결합하는 단백질들과도 결합을 하지 못하는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 DJ-1의 분자내 결합이 단백질 구조의 안정화와 적절한 기능을 수행하는데 중요한 요소임을 분명하게 보여준다. 즉, 활성산소종에 의해 단백질의 구조적인 변화가 일어나고, 또한 활성산소종에 영향을 받는 Cys 잔기들은 긴밀하게 연결되어 조절되고 있다는 것을 밝혔다. 이러한 시각은 앞으로 파킨슨 병을 포함한 항산화제 관련 질병치료를 위한 선도물질 탐색에 잠재적으로 도움이 될 것으로 예상된다.;Reactive oxygen species (ROS) are key molecules regulating various cellular processes. ROS are associated with many disease states, including cancer, diabetes, and neurodegenerative diseases. However, it remains unclear what the cellular targets of ROS are and how their functions are regulated. This study explored the cellular proteomic changes in response to oxidative stress using H2O2 in does- and recovery time-dependent ways, and found discernible changes in 76 proteins appearing as 103 spots on 2D-PAGE. Of these, Prxs, DJ-1, UCH-L3 and Rla0 are readily oxidized in response to mild H2O2 stress, and then degraded and active reduced proteins are newly synthesized during recovery. Multiple cellular modifications of redox sensitive proteins were identified by peptide sequencing with nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem mass spectrometry combining the DBond algorithm to search disulfide crosslinking. Reactive Cys residues of DJ-1 were detected employing NPSB-B labeling (specific chemical probe to label redox sensitive Cys residues) and confirmed by mutant studies. The oxidative and Cys mutational structural changes of peroxiredoxin-2 (Prx2) and DJ-1 were explored employing hydrogen/deuterium exchange-mass spectrometry (HDX-MS). In response to oxidative stress, C-terminal domain of Prx2 is exposed to surface, and Lys191 residue in this domain is polyubiquitinated, which are then readily degraded in proteasome and autophagy, while another redox sensitive protein DJ-1 has stable structure by forming Cys46-Cys53 intra-disulfide linkage. C46A mutant, not able to form Cys46-Cys53 crosslinking, made significant disturbance of its structure and lost its cellular activities. These findings indicate that oxidation-induced ubiquitination, degradation and intra-disulfide linkage to form stable structure can be quality control mechanism of oxidized redox sensitive proteins including Prxs and DJ-1. In addition, ROS generation via NADPH oxidase 4 (NOX4) in endothelial cells (ECs) was found to be regulated by UCH-L1 via VEGF signaling. UCH-L1 is required for the angiogenesis in HUVEC, because UCH-L1 increases ROS level by activating NOX4 by deubiquitination. This study identifies what the cellular targets of ROS, demonstrates how the protein structure and functions are regulated by ROS, and discloses the molecular mechanism ROS generation. These results are valuable to understand the regulation mechanism of ROS target proteins associated with various diseases.