Kinase activity independent inhibition between MLK2 and MLK3 MAP3K for JNK MAPK-AP-1 signaling pathway

Abstract

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), also known as pneumococcus, is a gram-positive bacteria with more than 90 serotypes. In healthy people, pneumococcus has no specific symptoms as a symbiotic, but in older people, children or patients with weakened immunity, it can cause invasive diseases such as pneumonia, meningitis, and sepsis. Immune response is effective way to kill pathogens such as pneumococcus that penetrate the host's body. However, uncontrolled inflammation causes various diseases. Therefore, controlling of accurate cell signaling mechanism is essential to regulate the inflammatory response. Mitogen activated protein kinase (MAPK) cascade is the one of the cellular pathway that induced by S. pneumoniae. MAPKs proteins are phosphorylated by MAP3Ks-MAP2Ks cascade and activates transcription factors, such as Activator protein-1 (AP-1), to regulate cellular signal transduction mechanism. MAP3K includes Mixed lineage kinase 2 (MLK2) and MLK3, which are serine and threonine kinase. Their activations phosphorylate down-stream proteins, such as JNK MAPK, to regulate transcription factor. CHIP, Carboxyl-terminus of HSC70 interacting protein, is the E3 ligase of ubiquitin proteasome system and regulates various biological phenomenon through degradation of target protein. Therefore, the study of the interaction between CHIP and other proteins is important. Recent studies showed that MLK3 regulation by CHIP regulates JNK activity. Studies on MLK3 are relatively well known, but not MLK2 or MLK2 and CHIP interaction has not been much studied. MLK3 is known to regulate pneumococcal inflammation-mediated by JNK MAPK signaling pathway. In this study, due to high homology with MLK3, the role of MLK2 in S. pneumoniae-mediated AP-1 activation has been studied. It has been confirmed that S. pneumoniae D39-mediated AP-1 activation was regulated by MLK2, and kinase enzyme activity of MLK2 plays a crucial role on MLK2-mediated activation of AP-1. Although both MLK2 and MLK3 activate AP-1, it was found that AP-1 activity was inhibited by co-expression of MLK2 and MLK3, and such an inhibitory effect of MLK2 and MLK3 co-expression on AP-1 activation was independent from their kinase enzyme activities. It was further found that MLK2 and MLK3 form heterodimer, which subsequently inhibits their auto-activation and subsequent activation of JNK MAPK-AP-1 signaling pathway. In addition, both MLK2 and MLK3 interact with CHIP, and ubiquitination and degradation of MLK2 and MLK3 was promoted by CHIP. Taken together, this study showed that MLK2 binds to MLK3 to form heterodimer, which inhibits homodimerization of MLK2 and MLK3 and subsequent auto-phosphorylation and auto-activation of MLK2 and MLK3, thereby negatively regulating MKK2- or MLK3-induced JNK1/2 MAPK-AP-1 signaling pathway independently from its kinase enzyme activity. In addition, MLK2 and MLK3 protein expressions were down-regulated by E3 ubiquitin ligase CHIP, and MLK3 binding to CHIP was further negatively regulated by MLK2. These results suggest that the regulatory mechanisms of MAPK signaling pathways are far more complicated than was previously known, and therefore, developing therapeutic strategies for pneumococcal infections should be in caution.;폐렴구균은 90가지 이상의 혈청형을 가지고 있는 그람 양성 균이다. 건강한 사람에서 폐렴구균은 공생 균으로써 특이적인 증상이 없으나, 면역력이 약한 노인이나 어린아이 또는 환자들에게서는 폐렴, 뇌수막염, 패혈증과 같은 침습성 질환을 유발할 수 있다. 염증반응은 숙주의 몸에 침투한 폐렴구균과 같은 병원체를 죽이는데 효과적이지만 과도한 염증은 오히려 조직 손상을 유발할 수 있기 때문에 적절한 염증 반응의 조절과 유지는 매우 중요하다. 폐렴구균 감염에 의해 MAPK 신호전달 기전을 포함한 다양한 신호전달 기전이 활성화된다. 이 중 MAPK 신호전달 기전은 MAP3K에 활성화되는 MAP2K에 의해 인산화 됨으로써 AP-1과 같은 전사인자를 활성화 하여 세포 신호전달 체계를 조절한다. MLK2와 MLK3는 대표적인 MAP3K 단백질로 표적 단백질의 세린과 트레오닌 아미노산을 인산화 시켜 표적 단백질의 활성을 유도한다. 특히, MLK3는 폐렴구균에 의한 JNK MAPK 매개 염증반응을 조절한다고 알려져 있다. 세포 내 단백질의 항상성 유지에 중요하다고 알려진 CHIP은 MLK3의 ubiquitination을 유도하여 MLK3 단백질의 발현을 감소시킴으로써 MLK3에 의한 염증신호 전달기전을 조절하는 것으로 알려져 있다. MLK2는 MLK3와 구조적 및 기능적으로 높은 상동성을 갖고 있음에도 불구하고 폐렴구균 감염과 같은 감염에 의한 염증 및 변역반응에서 MLK2의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 따라서 본 연구에서는 폐렴구균 감염에 의한 AP-1의 활성화 기전에서 MLK2의 역할을 규명하고, MLK2의 발현이 MLK3에 의한 AP-1의 활성화와 CHIP에 의한 MLK3의 발현 조절을 통한 MLK3에 의해 활성화되는 AP-1에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. MLK2는 인산화 효소 활성을 통해 폐렴구균에 의한 AP-1의 활성 유도에 관여함을 확인하였다. 흥미롭게도 MLK3와 MLK2가 둘 다 폐렴구균에 의한 AP-1의 활성 유도에 양성조절 기전으로 관여함에도 불구하고, MLK2의 발현은 MLK3에 의한 AP-1의 활성을 억제하였으며, MLK2에 의한 AP-1의 활성 또한 MLK3에 의해 억제됨을 확인하였다. 추가적인 연구를 통해 MLK2와 MLK3가 서로 이종이량체를 형성함으로써 서로의 동종 이량체가 형성되는 것을 물리적으로 억제하고, 결과적으로 서로의 인산화 효소로 서의 기능과 무관하게 서로의 효소 활성을 억제함을 확인하였다. 그 결과 주요한 하부 신호 전달 분자인 JNK MAPK과 AP-1의 활성이 억제됨을 확인하였다. 또한 MLK2가 MLK3와 마찬가지로 CHIP 단백질에 결합함을 확인하였으며, CHIP은 MLK2의 ubiquitination을 유도하여 단백질 발현을 억제함을 확인하였다. 흥미롭게도 MLK2와 CHIP의 결합은 MLK3의 CCHIP 결합을 억제하였으며, 이러한 실험결과는 MLK2와 MLK3가 CHIP에 대하여 상호 경쟁적으로 결합하며 이는 동일한 결합부위를 서로 공유할 수 있음을 시사한다. 본 연구의 결과를 종합하면, 이 연구는 MLK2가 MLK3와 이종이량체를 형성하여 MLK3 매개 JNK1/2 MAPK-AP-1 신호전달 기전을 인산화 효소 활성에 상관없이 음성적으로 조절한다는 것을 확인했다. 또한 MLK2 와 MLK3 단백질 발현은 CHIP에 의해 억제되었고, MLK3와 CHIP의 결합은 MLK2에 의해 조절됨을 확인하였다. 이러한 발견은 MAPK 신호 전달 조절의 조절 기전이 이전에 연구된 것보다 더 복잡하고 정교하므로 폐렴구균 감염에 대한 치료적 전략 개발에 있어 주의가 필요함을 시사한다.