Bioinformatics analysis of cellular heterogeneity at the single-cell level

Abstract

Single-cell analysis technologies provide unprecedented opportunities to look into the detailed dynamic processes within and between cells at a single-cell level, which has been a long-time dream for many biologists. They are expected to offer deep insights into virtually all subjects of biological problems, including tissue and organ development, disease etiology and progress, response to external stimuli such as drugs, etc. Numerous biological studies have been utilizing single-cell methods actively since the single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) became commercially available by the 10X Genomics company. In this thesis, I present the development of computational pipelines for analyzing scRNA-seq data and their applications to study i) the single-cell composition of developing organoids to spinal cords and ii) tumor evolution due to immune checkpoint therapy in a syngeneic mouse model of lung cancer. With rapid advances in single-cell technologies over the last decade, numerous computational algorithms and tools have been devised. I briefly introduce the essence of algorithms, methods, and standard workflows developed to analyze the single-cell data. I also present a computational pipeline used in the thesis works, following the state-of-the-art methods to overcome various challenging issues of single-cell analysis, including data sparsity problems and ambiguity in the cell type annotation. I apply this in-house pipeline to analyze the scRNA-seq data for two organoid models of spinal cord development that were generated with a new protocol. I demonstrate that our organoids reproduce the essential properties of human spinal cords by identifying the neuronal cell types and inferring their developmental processes from the scRNA-seq data. I also conduct an integrated multimodal analysis that combines scRNA-seq data with spatial transcriptome data to show the 3D patterning of neurons as a model of dorsoventral axis development in polarized spinal cord organoids. In the last chapter, I study the tumor evolution in response to immune checkpoint therapy in a syngeneic mouse model of lung cancer. Single-cell RNA-seq data at various time points were obtained in a syngeneic mouse model with Lewis lung carcinoma cells. I calculate the cell type composition from the scRNA-seq data and analyze their changes associated with pembrolizumab treatment. Importantly, I find that natural killer cells stimulate dendric cells in response to the anti-PD1 (pembrolizumab) therapy, which in turn activates antigen presentation in dendritic cells. In conclusion, my thesis introduces a computational pipeline for single-cell data analysis, proposes a new approach to cell type assignment, and describes how these methods can deduce biologically meaningful insights from the scRNA-seq data sets of spinal cord development and cancer immunotherapy. ;단일 세포 분석 기술은 많은 생물학자들에게 단일 세포 수준에서 세포 내부와 세포 사이의 상세한 동적 과정을 연구할 수 있는 전례 없는 기회를 제공했다. 이 분석 기법은 조직 및 장기의 발달, 질병의 병인 및 진행, 약물과 같은 외부 자극에 대한 반응 등 거의 모든 주제의 생물학적 문제 적용되어 기존의 bulk 분석에서는 얻을 수 없는 깊은 통찰력을 제공하고 있다. 본 논문에서는 scRNA-seq 데이터를 분석하기 위해 개발한 컴퓨터 파이프라인을 소개하고, 이를 응용해 진행한 두 가지 연구, i) 인간 척수의 발달과정을 보여주는 오르가노이드의 단일 세포 구성 연구 와 ii) 폐암 동계 마우스 모델에서 면역 관문 항암치료 과정 동안의 종양 진화 연구,에 대해 다룬다. 지난 십여 년간 단일 세포 데이터 제작 기술은 한 번에 많은 양의 세포에 대한 데이터를 얻을 수 있는 방향으로 급격히 성장했고, 고속 대량 생산된 데이터를 다룰 컴퓨터 알고리즘과 소프트웨어도 함께 개발되었다. 저자는 단일 세포 데이터 분석을 위해 개발된 알고리즘과 방법론의 원리를 간략히 정리했다. 또한 최신 분석 방법들을 융합해 전용 분석 파이프라인을 개발했고, 이를 통해 데이터 성김 문제와 세포 유형 확인의 애매성같이 단일 세포 데이터 분석 과정에서 생기는 문제들을 해결하고자 했다. 저자는 자체 제작 파이프라인을 새로운 프로토콜로 만든 두 가지 인간 척수 오르가노이드 모델의 단일 세포 전사체 시퀀싱(scRNA-seq) 데이터에 적용하여 오르가노이드 안에 존재하는 신경세포의 종류를 구분하고 그 분화 과정을 추론했다. 분석 결과를 통해 만들어진 오르가노이드가 인간 척수의 필수적인 성질을 재현할 수 있다는 것을 보였다. 저자는 또한 scRNA-seq 데이터와 공간 전사체 데이터의 통합 분석을 수행해 신경 세포의 3차원 배치를 확인했고 배복축 발달을 보여주는 모델로서 양극화된 척수 오르가노이드의 효용성을 증명했다. 본 논문의 마지막 단원에서는, 폐암 동계 마우스 모델에서 면역 관문 항암치료에 대한 반응으로 일어나는 종양 진화 과정을 단일 세포 단위로 관찰한 내용을 다룬다. 동계 마우스 모델은 Lewis lung carcinoma 세포주로 만들어졌으며, 항암치료 시작부터 진행되는 과정에 걸쳐 다양한 시점에 대해 scRNA-seq 데이터를 얻었다. 데이터 분석을 통해 세포 유형의 비율을 확인하고 세포 내 유전자 발현 변화 등 pembrolizumab 치료제에 의한 영향을 확인했다. 본 연구를 통해 자연 살상 세포가 면역 관문 억제제(anti-PD1, pembrolizumab)에 대한 반응으로 수지상세포를 자극해 항원 제시 능력을 활성화시킨다는 중요한 사실을 발견했다. 정리하자면, 본 학위논문에서는 단일 세포 데이터 분석을 위한 컴퓨터 파이프라인을 소개하고 새로운 세포 유형 할당 방법을 제안, 이 방법론으로 어떻게 척수 발달 및 암 면역 요법의 scRNA-seq 데이터에서 생물학적으로 의미 있는 결과를 추론했는지 설명한다.