The neural mechanisms regulating core symptoms of autism spectrum disorder produced by genetic and non-genetic factors

Abstract

Autism spectrum disorder (ASD) is a group of neurodevelopmental disorders characterized by the two core domains of ASD; social communication deficits and repetitive behaviors. Recent studies have identified over 1,000 ASD-associated genes and helped expand our understanding ASD-related neuropathology. However, the fundamental question of whether ASD core symptoms are produced by dysfunction of neural network(s) distributed widely in the brain or in specific brain region(s) is not clearly answered. The dorsal striatum is the brain region that coordinates the synaptic inputs from cortical and subcortical regions and sends outputs to other regions of the basal ganglia. A growing body of evidence indicates that functional deficits in the dorsal striatum promote sociability impairment and repetitive behaviors. Neuroimaging study reported that increased striatal volume is associated with autism spectrum disorder (ASD). However, whether specific dysfunction of the dorsal striatum is sufficient to produce ASD core symptoms is not clearly understood. The dorsal striatum receives excitatory glutamatergic inputs from cortical and subcortical regions, and dopaminergic inputs from the substantia nigra. Recently, it was demonstrated that glutamatergic inputs from the prelimbic cortex are important in regulating autistic-like behaviors. In the present study, it was examined whether dopaminergic inputs from the substantia nigra have a role in regulating autistic-like behaviors. Mice with increased dopamine functions in the dorsal striatum through the siRNA-mediated suppression of dopamine transporter expression in the substantia nigra neurons or by optogenetic stimulation of the nigro-striatal circuitry exhibited sociability deficits and repetitive behaviors, while these behavioral changes were blocked by SCH23390, a D1 receptor antagonist. Pharmacological activation of D1 receptors or the knockout (KO) of D2 receptors also produced social deficits and repetitive behaviors. Furthermore, siRNA-mediated D2 receptor knockdown within the dorsal striatum in wildtype mice produced autistic-like behaviors as D2 KO mice displayed. D2 KO mice had increased levels of p-CaMKIIα or p-ERK2 in the dorsal striatum, whereas siRNA-mediated knockdown of CaMKIIα or ERK2 partially mitigated autistic-like phenotypes of D2 KO mice. It was also examined whether behavioral impairments of D2 KO mice could be modulated by rebalancing glutamate and/or dopamine receptor activity in the dorsal striatum. Administration of D-cycloserine (an NMDA agonist), or fenobam (an mGluR5 antagonist) rescued behavioral deficits of D2 KO mice. Administration of ecopipam (a D1 partial antagonist) suppressed autistic-like symptoms of D2 KO mice. Next, it was investigated whether functional deficits of well-known ASD-related genes in the dorsal striatum could produce ASD core symptoms. It was demonstrated that siRNA-mediated inhibition of Shank3, Nlgn3, Fmr1, Mecp2, or Tsc1 in the dorsal striatum produced mild to severe changes in sociability, cognition, and/or repetitive behaviors. The knockdown effects of Mecp2 and Tsc1 on behavioral changes were the most prominent. Behavioral changes induced by striatal inhibition of MeCP2 or TSC1 were rescued by D-cycloserine (an NMDA agonist), fenobam (an mGluR5 antagonist), SCH23390 (a D1 antagonist) and/or ecopipam (a D1 partial antagonist), the pharmacological drugs that are known to regulate ASD-like symptoms in animal models. A polymorphism in dopamine D2 receptors (D2; rs1800498TT) has been identified in ASD patients. D2 KO mice exhibited typical autistic-like behaviors including sociability deficits and increased grooming, whereas D2 heterozygous mice did not show such deficits. Given that ASD is a neurodevelopmental disorder, and ASD of individuals with a genetic defect is likely manifested in a heterozygous state through changes in development, it was investigated whether D2 heterozygous mice could develop ASD-like symptoms when they were exposed to developmental stress. To address this, D2 heterozygous pups from postnatal day 2 were exposed to maternal separation stress for 3 h daily for 14 days. D2+/-mice grown after the early-life stress (ELS) exhibited impairments in social interaction in the three chamber test, reduced sniffing in the reciprocal social interaction test, and increased grooming, whereas wildtype mice exposed to ELS did not show such phenotypes. Real-time PCR analysis indicated that D2+/- mice exposed to ELS had decreased levels of TrkB, Bdnf, Mecp2, Hdac2 and Hdac3 in the dorsal striatum. Western blot analysis revealed that p-AKT and p-ERK1/2 levels were reduced in the striatum of D2+/- mice exposed to ELS. Based on these results, it was questioned whether behavioral deficits in D2+/- mice exposed to ELS could be rescued by activation of TrkB receptors. Administration of 7,8-DHF (7,8-Dihydroxyflavone, a TrkB agonist) in D2+/- mice exposed to ELS increased social interaction in the three chamber test, sniffing behavior in the reciprocal social interaction test, and reduced grooming. In contrast, 7,8-DHF induced behavioral rescue was blocked, when TrkB was inhibited by injection of TrkB-siRNA in the dorsal striatum of ELS-treated D2+/- mice. Together, the results of the present study suggest that the dorsal striatum is the critical neural center mediating ASD common core symptoms. In the dorsal striatum, glutamate and dopamine receptor systems are reciprocally interactive, while imbalanced activation of specific glutamate or dopamine receptors produces ASD-like core symptoms. It was demonstrated that antagonizing imbalanced activation of specific glutamate and/or dopamine receptors in the dorsal striatum suppresses ASD-like behavioral symptoms. ;자폐 범주성 장애 (Autism spectrum disorder, ASD, 자폐증)는 사회적 소통 장애와 반복적인 상동행동이라는 공통의 핵심 증상을 보이는 발달장애이다. 최근까지 자폐와 연관된 1,000 여개가 넘는 유전자들이 보고되었다. 그러나, 이와 같은 연구 성과에도 불구하고 자폐 범주성 장애의 주 공통 핵심 증상을 유발하는 뇌 지역과 뇌 신경회로에 대해서는 명확하게 밝혀져 있지 않다. 등쪽선조체(Dorsal striatum)는 대뇌피질(Cortex)로부터 들어오는 신경회로의 정보를 받아 다른 부위의 대뇌기저핵(Basal ganglia) 지역으로 보내는 뇌 지역으로, 최근 등쪽선조체 지역의 결함에 의한 사회성 장애와 상동행동 유발의 연관성을 나타내는 연구 결과들이 보고되었다. 뇌영상촬영 연구를 통하여 자폐환자들에게서 등쪽선조체 부피가 증가되어 있는 것이 알려졌다. 그러나, 직접적으로 등쪽선조체에 의하여 유도되는 자폐증 공통 핵심 증상의 기전은 명확히 알려져 있지 않다. 등쪽선조체는 대뇌피질로부터 글루타메이트(Glutamate) 신경회로의 자극 및 대뇌기저핵의 흑질(Substantia nigra)로부터 도파민(Dopamine) 신경회로의 자극을 받는다. 최근 본 연구자가 참여한 연구에서 대뇌피질 지역(prelimbic cortex, PrL)으로부터 등쪽선조체로 이어지는 글루타메이트 신경회로의 과활성화가 사회성 장애 행동을 유도하는 것을 규명한 바 있다. 이에 본 연구에서는 흑질 지역으로부터 등쪽선조체로 향하는 도파민 신경회로가 자폐행동을 조절하는지를 조사하였다. 흑질에서 등쪽선조체로 전달되는 도파민 신경회로를 광유전학 방법으로 활성화시키거나, 흑질의 도파민 수송체(Dopamine transporter, DAT)의 발현을 감소시켜 등쪽선조체에 작용하는 도파민의 작용을 증가시켰을 시, 사회성 행동 장애와 더불어 상동행동이 유발되는 것을 관찰하였다. 약물학적으로 도파민 1 수용체(Drd1, D1)를 과활성화 시킨 마우스와, 도파민 2 수용체(Drd2, D2)가 결핍된 마우스 (D2 KO mice)에게서 자폐행동이 나타나는 것을 관찰하였다. 이러한 연구결과들은 도파민 1 수용체가 과활성화 되거나 도파민 2 수용체의 발현이 감소된 경우에 사회성 행동이 억제되고 상동행동이 증가하는 것을 의미하며, 이러한 행동변화는 D2-siRNA를 이용해 등쪽선조체 특이적으로 도파민 2 수용체를 감소시켰을 시에도 유사하게 유도되었다. 최근의 연구 및 본 연구를 통해 확보된 정보에 근거하여 다양한 약물을 이용하여 도파민 2 수용체가 결핍된 마우스의 행동결핍을 회복시키기 위한 실험을 진행하였다. NMDA 수용체 작용제 (NMDA receptor agonist), mGluR5 길항제 (mGluR5 antagonist), 도파민 1 수용체 길항제 (D1 receptor antagonist)들을 처치하여 도파민 2 수용체 결핍 마우스의 감소된 사회성 행동과 증가된 상동행동을 정상 수준으로 완화시킬 수 있었다. 다음으로 등쪽선조체가 자폐증상의 공통 핵심증상을 조절하는 뇌 부위라는 본연구의 핵심적 발견을 검증하기 위해, 기존에 자폐 행동을 유발하는 것으로 잘 알려진 유전자들을 등쪽선조체 제한적으로 억제할 시 자폐행동이 나타나는지 조사하였다. 각각의 유전자에 대한 siRNA를 등쪽선조체에 미세 주입하는 기법을 사용하여, Mecp2, Tsc1, Shank3, Nlgn3, Fmr1의 유전자의 발현을 등쪽선조체 특이적으로 감소시켰다. 비록 각 유전자마다 행동 유발에서 차이가 있었으나 각 유전자들을 등쪽선조체 제한적으로 억제하였을 시 다양한 행동검사에서 자폐행동을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 조사한 유전자 중에서 Mecp2, Tsc1의 유전자의 결함이 가장 뚜렷한 자폐행동을 유도하였다. 추가 연구를 통해 등쪽선조체 특이적으로 Mecp2, Tsc1 유전자가 감소된 마우스의 경우에도 글루타메이트와 도파민 시스템 조절 약물을 통하여 자폐행동을 완화할 수 있는 것을 확인하였다. 이상의 본 연구를 통하여 제시된 바와 같이 도파민 2 수용체의 유전적 결함은 자폐와 밀접한 연관성을 갖는 것을 알 수 있었다. D2-/- 마우스는 전형적인 자폐행동을 나타내나, D2+/- 마우스는 자폐증상을 나타내지 않았다. 유전적 원인에 기인하는 자폐의 경우 대체로 유전자의 이형 접합(heterozygous) 상태에서 자폐증상이 나타나며, 자폐는 어린 시기 증상이 나타나는 신경발달장애라는 점들을 고려할 때, 발달과정에 작용하는 비유전적 원인이 자폐를 유발하는 중요한 기전으로 간주된다. D2 수용체의 결함에 따른 자폐 유발의 경우도 비유전적 원인과의 상호작용의 결과로 유도될 가능성이 매우 크다. 이에 본 연구는 D2+/- 마우스가 발생 초기과정에 과도한 스트레스를 받았을 시 자폐행동이 초래될 수 있다는 가설을 검증하고, 또 그러할 경우 환경적 요인과 유전적 요인이 어떻게 상호작용하여 자폐증상을 유발하는지 그 기전을 밝히고자 하였다. 이와 같은 가설을 검증하기 위해 발달과정에 작용하는 비유전적 요인/환경적 요인으로서 태어난 지 2일부터 14일까지 하루에 3시간씩 엄마로부터 새끼를 분리하는 생애-초기-스트레스 (Early-life stress) 처치에 따른 자폐 행동발생 여부를 조사하였다. 생애초기스트레스를 받은 후 자란 D2+/- 마우스는 사회성 감소와 상동행동의 증가를 보이는 것을 확인하였다. 그러나, 같은 생애초기스트레스를 받았음에도 불구하고 정상 마우스는 전혀 자폐행동을 보이지 않았다. D2+/- 마우스에게 생애초기스트레스를 주었을 경우, 등쪽선조체 지역에서 TrkB, BDNF, Mecp2, Hdac2, Hdac3의 유전자 발현이 감소한 것을 확인하였다. 이에 근거하여 TrkB 작용제 (TrkB agonist, 7,8-dihydroxyflavone, 7,8-DHF) 투여는 생애초기스트레스에 노출된 D2+/- 마우스의 자폐행동을 억제할 뿐만 아니라, 생애 초기 스트레스에 의해 감소된 TrkB, BDNF, Mecp2, Hdac2, Hdac3의 유전자 발현을 대조군 마우스 수준으로 회복시켰다. TrkB-siRNA를 이용하여 등쪽선조체 내의 TrkB 활성을 지역 특이적으로 억제한 조건에서는 7,8-DHF에 의한 자폐행동의 회복 효과가 나타나지 않았다. 이와 같은 결과들은 생애초기스트레스에 의해 초래되는 BDNF-TrkB 수용체 신호전달 경로의 저하 및 활성에 의한 자폐행동의 완화가 등쪽선조체를 통하여 일어나는 것을 의미한다. 종합적으로, 본 연구는 등쪽선조체의 글루타메이트와 도파민, BDNF-TrkB 시스템의 불균형에 의해 자폐행동이 유도되는 것을 규명하였으며, 등쪽선조체에 작용하는 글루타메이트와 도파민 시스템의 불균형을 적절하게 조절할 경우 자폐행동을 완화할 수 있다는 것을 밝혔다. 나아가, 본 연구는 등쪽선조체가 자폐의 주요 행동증상을 담당하는 핵심지역이라는 것을 규명하였다.