A search for antibiotic candidates targeting sugar nucleotidyltransferases using biochemical and X-ray crystallographic methods

Abstract

Since antibiotics were developed, antibiotics have been used to save innumerable human lives and eventually expand the average human life expectancy. However, the pathogenic bacterial strains resistant to conventional antibiotics are rapidly increasing. Consequently, the medical community and related workers are receiving severe tension due to the growing number of multidrug-resistant (MDR) strains. So it is imperative to find new targets for antibiotics and develop antibiotics or adjuvants against MDR microbes. Recently, heptose biosynthesis pathways, producing components of bacterial lipopolysaccharide, have attracted attention as novel antibiotic targets to reduce the pathogenicity, growth of bacteria and increase their sensitivity to antibiotics. Since there are no antibiotics targeting these pathways available, many research groups are studying these biosynthesis pathways to develop novel antibiotics. Burkholderia pseudomallei is dangerous enough to be classified as a potential bioterrorist weapon, and one of the bacteria increasing infection and death rates in Southeast Asia and the tropics. In addition, they are remarkably resistant to various antibiotics. Another pathogenic bacterium Yersinia pseudotuberculosis is highly related to Y. pestis and causes yersiniosis with symptoms of ileitis and mesenteric lymphadenitis in humans. Some of Y. pseudotuberculosis strains were also reported to show antibiotic resistance. D-glycero-β-D-manno-heptose-1-phosphate adenylyltransferase from B. pseudomallei (BpHldC) is the fourth enzyme in the ADP‐L‐glycero‐β‐D‐manno‐heptose biosynthesis pathway producing a core component. Therefore, BpHldC is an anti-melioidosis target. In this study, a flavonoid library was employed to probe inhibitors of BpHldC and two flavonoids, epigallocatechin gallate (EGCG) and myricetin, have been discovered. Enzyme kinetics study showed that two flavonoids work through different mechanisms to block the catalytic activity of BpHldC. Among them, a docking study of EGCG was performed and the binding mode could explain its competitive inhibitory mode for both ATP and β-D-glucose-1-phosphate (βG1P). Analyses with EGCG homologues could reveal the important functional moieties, too. An in-house chemical library was also employed and three compounds (ChemBridge compounds purchased from ChemBridge Corporation) were found to have an effective inhibitory activity on BpHldC. Interestingly, ChemBridge 7929959 was the most effective compound due to the presence of the terminal benzyl group. The enzyme kinetic study revealed that most of them show mixed type inhibitory modes against ATP and βG1P. The induced-fit docking indicated that the high affinity of ChemBridge 7929959 is originated from its benzyl group occupying the substrate-binding pocket of BpHldC. The inhibitory role of terminal aromatic groups was proven with ChemBridge 7570508. Combined with another study, ChemBridge 7929959 is found to work as a dual inhibitor against both HldC and HddC. This study is the first example of uncovering the inhibitory activity of several compounds against the ADP‐L‐glycero‐β‐D‐manno‐heptose biosynthesis pathway. Since there are no therapeutic agents and vaccines available against melioidosis, EGCG, myricetin and ChemBridge compounds can be used as templates to develop antibiotics over B. pseudomallei with a novel inhibitory concept. D-glycero-α-D-manno-heptose-1-phosphate guanylyltransferase (HddC) is the fourth enzyme synthesizing a building component of lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria. Since HddC is a potential new target to develop antibiotics, the analysis of the structural and functional relationship of the complex structure will lead to a better idea to design inhibitory compounds. To elucidate the guanine preference, X-ray crystallography and biochemical experiments were performed based on the multiple sequence alignment. The crystal structure of HddC from Y. pseudotuberculosis (YpHddC) complexed with guanosine 5′-(β-amino)-diphosphate (GMPPN) has been determined at 1.55 Å resolution. Meanwhile, the mutants revealed their reduced guanine affinity, instead of acquiring noticeable pyrimidine affinity. The complex crystal structure revealed that GMPPN is docked in the catalytic site with the aid of Glu80 positioning on the conserved motif EXXPLGTGGA. In the HddC family, this motif is expected to recruit nucleotides through interacting with bases. The crystal structure shows that oxygen atoms of Glu80 forming two hydrogen bonds play a critical role in interaction with two nitrogen atoms of the guanine base of GMPPN. Interestingly, the binding of GMPPN induced the formation of an oxyanion hole-like conformation on the L(S/A/G)X(S/G) motif and consequently influenced on inducing a conformational shift of the region around Ser55. The studies of HldC and HddC have provided an insight into developing novel antibiotics targeting heptose biosynthesis pathways by discovering potential inhibitory compounds, determining an X-ray crystal structure and predicting in-silico docking modes. ;항생제가 개발된 이래로, 항생제는 수많은 인간의 생명을 구하고 결국 평균 수명을 연장하는 데 기여하였다. 그러나 기존 항생제에 내성이 있는 병원성 세균 균주가 급증하고 있다. 특히 다제 내성 균주의 증가로 인해 의료계와 관련 종사자들이 크게 긴장하고 있다. 따라서 항생제의 새로운 표적을 찾고 다제 내성 미생물에 대한 항생제 또는 보조제를 개발하는 것이 필수적이다. 최근, 박테리아의 지질 다당류 (lipopolysaccharide, LPS) 의 구성물질을 합성하는 헵토오스 생합성 경로는 박테리아의 병원성과 성장속도를 줄이고 항생제에 대한 민감성을 높이기 위한 새로운 항생제 표적으로 주목을 받고 있다. 이러한 경로를 표적으로 하는 항생제가 없기 때문에 많은 연구 그룹들이 새로운 항생제를 개발하기 위해 이러한 생합성 경로를 연구하고 있다. 유비저균 (Burkholderia pseudomallei) 은 잠재적인 생물 테러 무기로 분류 될 만큼 위험하며, 동남아시아와 열대 지방에서 감염 및 사망률을 증가시키는 박테리아 중 하나이다. 또한 다양한 항생제에 대한 내성이 뛰어나다. 또 다른 병원성 박테리아인 예르시니아 슈도튜베르큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis) 는 페스트균 (Yersinia pestis) 과 밀접한 관련이 있으며 인간의 회장염 및 장간막 림프절염의 증상을 나타내는 예르시니아증 (yersiniosis) 을 유발한다. 일부 예르시니아 슈도튜베르큘로시스 균주도 항생제 내성을 보이는 것으로 보고되었다. 본 논문에서는 유비저균과 예르시니아 슈도튜베르큘로시스의 헵토오스 생합성 효소에 대해 연구를 진행하였다. 유비저균의 D-glycero-β-D-manno-heptose-1-phosphate adenylyltransferase (BpHldC) 는 LPS의 핵심 성분을 생산하는 ADP-L-glycero-β-D-manno-heptose 생합성 경로에서 네 번째 효소이다. BpHldC는 D-glycero-β-D-manno-heptose-1-phosphate에 ATP로부터 AMP 부분을 옮겨주는 반응을 촉매한다. 본 연구에서는 BpHldC를 항유비저의 표적으로서 플라보노이드 라이브러리를 사용하여 이 단백질의 억제제를 탐색했는데, 원래 기질인 D-glycero-β-D-manno-heptose-1-phosphate는 구하기가 어려워 그와 비슷한 구조를 지닌 β-D-glucose-1-phosphate를 이용하여 수행했다. 70여개의 플라보노이드들 중 에피갈로카테킨갈레이트 (epigallocatechin gallate, EGCG)와 미리세틴 (myricetin) 이 저해 활성이 있다는 것을 발견하였다. 효소 억제 동역학 연구 (enzyme inhibitory kinetics) 에 따르면 두 개의 플라보노이드가 서로 다른 메커니즘을 통해 BpHldC의 촉매 활성을 차단하는 것으로 나타났다. 그 중 경쟁적 저해 양상을 나타내는 EGCG를 컴퓨터 프로그램을 통해 도킹 연구 (docking study) 가 수행했다. EGCG 유사물질들의 저해 활성 분석도 수행하였는데 이를 통해 중요한 구조-기능적 관련 특성도 밝혀 낼 수 있었다. 연구실 내 화학물질 라이브러리도 BpHldC의 저해 활성 스크리닝에 사용되었으며 그 중 ChemBridge사에서 구입한 세 가지 화합물 (ChemBridge 7929959, ChemBridge 7933420, ChemBridge 7991890) 들이 BpHldC에 대해 효과적인 억제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도 ChemBridge 7929959는 말단 벤질 그룹의 존재로 인해 가장 저해 활성이 높게 나타나는 화합물이었다. 효소 억제 동역학 연구를 통해 세 물질들 중 대부분이 ATP 및 βG1P에 대해 혼합형 억제 모드 (mixed-type inhibitory mode) 를 보여주는데 이들 물질 또한 도킹 연구를 진행했다. 이 연구를 통해 BpHldC에 대한 ChemBridge 7929959의 높은 친화성이 BpHldC의 기질 결합 포켓을 차지하는 벤질 그룹으로 인한 것임을 유추할 수 있었다. 다른 연구들을 통해 ChemBridge 7929959는 BpHldC 및 예르시니아 슈도튜베르큘로시스의 D-glycero-α-D-manno-heptose-1-phosphate guanylyltransferase (HddC) 모두에게 억제 작용하는 것으로 밝혀졌다. 본 연구는 ADP-L-glycero-β-D-manno-heptose 생합성 경로에 대하여 억제 활성을 보이는 여러 화합물을 밝혀낸 첫 연구이다. 유비저에 대해 사용할 수 있는 치료제와 백신이 없기 때문에 EGCG, myricetin 및 ChemBridge 화합물을 주형 (template) 으로 사용하여 새로운 타겟을 억제하는 유비저균에 대한 항생제를 개발할 수 있을 것이다. 예르시니아 슈도튜베르큘로시스의 D-glycero-α-D-manno-heptose-1-phosphate guanylyltransferase (YpHddC)는 그람 음성균의 지질 다당류 구성 성분을 합성하는 GDP-D-glycero-α-D-manno-heptose 생합성경로의 네 번째 효소이다. HddC의 구아닌 (guanine) 선호도를 밝히기 위해 X- 선 결정학 및 생화학 실험을 수행했다. 첫째로, 구아노신 5 '-(β- 아미노)-디포스페이트 (guanosine 5′-(β-amino)-diphosphate, GMPPN)가 결합된 YpHddC의 결정 구조를 규명했다. 두번째로, YpHddC가 아미노산 서열 중 한 개나 두개의 아미노산이 변이된 효소들은 피리미딘계 (pyrimidine) 염기에 대한 친화도는 거의 높아지지 않았고 대신, 구아닌의 친화성이 감소했다. 결정 구조를 분석해 보면 GMPPN이 보존된 모티프 (conserved motif) 인 EXXPLGTGGA이 포함된 포켓에 결합되어 있는데, 특히 Glu80와의 결합으로 YpHddC의 촉매 부위에 결합되어 있음을 보여주었다. HddC와 유사한 서열, 구조 그리고 기능을 가진 효소들은 이 모티프와 염기의 상호 작용을 통해 핵산과 결합 할 것으로 예상된다. 결정 구조는 두 개의 수소 결합을 형성하는 Glu80의 산소 원자가 GMPPN의 구아닌 염기의 두 질소 원자와 상호 작용하는 데 중요한 역할을한다는 것을 보여준다. 흥미롭게도, GMPPN의 결합은 L(S/A/G)X(S/G) 모티프에 옥시 음이온 홀과 같은 (oxyanion hole-like) 입체 구조의 형성을 유도하고 결과적으로 Ser55 주변 영역의 입체 구조가 변형하는 데 영향을 미쳤다. 정리하면, HddC 또한 항생제 개발의 잠재적인 새로운 표적이 될 수 있기 때문에 이 단백질의 복잡한 구조의 구조적 및 기능적 관계를 분석하면, 저해제를 디자인할 때 더 나은 아이디어를 제공할 수 있을 것이다. 즉, HldC 및 HddC의 연구는 잠재적인 저해제들을 발견하고, X 선 결정 구조를 규명하여 in silico 도킹 모드를 예측함으로써 헵토오스 생합성 경로를 표적으로 하는 새로운 항생제 개발에 대한 접근법을 제공한다.