Integrative analysis of next-generation sequencing data for precision treatment of lung cancer

Abstract

Cancer has heterogeneity of phenotypic and molecular characteristics at both intertumoral and intratumoral levels. Despite numerous cancer studies being conducted by researchers, the diversity and heterogeneity of tumors are still hard to fully understand. Since the heterogeneity of tumors is a major factor affecting prognosis and therapeutic outcomes, personalized precision medicine is needed, taking into account the heterogeneous characteristics of the patient for the treatment. Lung cancer accounts for the largest percentage of cancer incidence and mortality worldwide, regardless of gender and race. Lung cancer is divided into non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC) according to morphological classifications, of which NSCLC is also divided into lung adenocarcinoma (LUAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) and large cell carcinoma (LCC). However, accumulated evidence suggests that lung cancer is a morphologically and molecularly heterogeneous disease, even within the same morphological subtype. Recently, with the development of next-generation sequencing data analysis, such as whole-exome sequencing (WES) and mRNA sequencing, the previous classification of lung cancer based on tissue morphology has led to molecular-based classification. Moreover, studies using NGS data are also being actively conducted to identify targets and mechanisms that play a key role in lung cancer. This study introduces three projects using NGS data for the realization of precision medicine for lung cancer. First, we stratified LUAD patients as subtypes with distinct genetic characteristics using WES and mRNA sequencing data. We have confirmed that 245 LUAD patients from three cohorts are divided into five subtypes. We focused on revealing the clinical implications of each subtype. To identify the molecular features of subtypes, up-regulated signature genes and pathways were analyzed in each subtype, which confirmed the heterogeneity and progression mechanisms of LUAD. Also, each subtype showed significant differences in long-term survival outcomes in the survival analysis results. It suggests that our findings have potential diagnostic value in LUAD. We also explored personalized treatment options that are expected to be effective in each subtype according to the molecular characteristics of them. These results provide comprehensive molecular characterization and patient classification scheme for LUAD patients, which would be meaningful in providing opportunities for developing strategies to realize precision medicine for LUAD patients. Secondly, we validated the utility value of the lung cancer patient-derived xenograft (PDX) model through WES data. Preclinical models reflecting the heterogeneous properties of tumors are necessary for efficient cancer research. The PDX mouse model, which implants the tumor tissue of a patient directly into the immunodeficiency mouse, can overcome many limitations of the conventional cell line model, and it retains the heterogeneity of patient tumors. In this project, we compared somatic mutations of PDX tumors and patient tumors using matched-normal samples for 132 lung cancer patients. We analyzed common mutations of patients and PDX tumors to confirm how faithfully the PDX model recapitulates the genetic characteristics of patients. The PDX model recapitulates the variants that patients have, quite well, and those variants were maintained over the generation of PDX. Of note, some actionable variants for targeted-therapies were also identified, suggesting that the PDX model could be used to verify drug screening in personalized cancer treatment strategies. Third, we found that the TNNC1 gene acts as a tumor suppressor in LUAD by using mRNA sequencing data. The identification of oncogenes or tumor suppressor genes that affect the prognosis of the patient is also important for the precision diagnosis in cancer. Numerous studies have suggested that many mutations, differential expressed genes, and altered pathways are involved in the progression and development of cancer. But it is important, among them, to distinguish between so-called passenger and driver events. Through analysis of the expression data of in-house LUAD patients and LUAD patients in TCGA, we observed a lower expression of TNNC1 in most LUAD patients tumor and found that TNNC1 acts as a tumor suppressor gene. The analysis of pathway activity score confirmed that TNNC1 was involved in cell growth, cell cycle arrest and DNA damage response, and it was verified experimentally using two independent cell lines. The survival analysis also demonstrated that the lower expression of TNNC1 is highly related to the bad prognosis of the LUAD patients. It suggests that TNNC1 has potential diagnostic value in LUAD.;암은 형태나 분자적 측면에서 매우 이질적인 특성을 지니고 있다. 수많은 암 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고 종양의 다양성과 이질성은 여전히 완전히 이해하기 어려운 실정이다. 암의 이질성은 치료 예후와 결과에 영향을 미치는 주요 요인이기 때문에 환자의 치료를 위해서는 환자 종양의 이질적 특성을 고려한 개인별 정밀 의료가 필요하다. 폐암은 인종과 성별을 불문하고 전세계적으로 암 발병과 사망률에서 가장 큰 비중을 차지한다. 폐암은 형태학적 분류에 따라 비소세포폐암과 소세포폐암으로 나뉘고, 그 중 비소세포폐암은 다시 폐선암과 편평세포암, 대세포암으로 나뉜다. 하지만 폐암은 동일한 형태적 서브타입 안에서 조차 형태나 분자적으로 이질적인 질병이라는 근거가 축적되고 있다. 최근에는 유전체 분석이나 전사체 분석기술과 같은 차세대 시퀀싱(NGS) 데이터 분석 기술의 발전으로 종전의 조직형태학 기반의 폐암 분류가 분자 기반의 분류로 이어지고 있다. 이와 더불어 폐암 발병에 핵심 역할을 하는 표적 타겟과 메커니즘을 밝히기 위해 NGS 데이터를 활용한 연구도 활발하다. 본 논문에서는 폐암의 정밀 의료 실현을 위해 NGS 데이터를 활용한 연구 세 가지를 소개한다. 첫번째로 우리는 전사체 데이터를 이용하여 폐선암 환자를 유전적 특성이 구별되는 하위 집단으로 분류하였다. 세 코호트로부터 얻은 245명의 폐선암 환자들은 5개의 서브타입으로 나뉘었다. 우리는 각 서브타입의 임상적 함축성을 밝히는 것에 초점을 맞췄다. 서브타입들의 분자적 특성을 확인하기 위해 각 서브타입에서 특별히 높은 활성을 나타내는 유전자들과 패스웨이들에 대해 분석하였고, 이를 통해 폐선암의 이질성과 진행 메커니즘을 확인하였다. 또한 각 서브타입들은 생존분석 결과에서 장기 생존 예후에 유의미한 차이를 보이고 있었다. 이는 우리의 연구 결과가 폐선암에서 잠재 진단적 가치를 가지고 있음을 시사한다. 또한 우리는 각 서브타입의 분자적 특성에 따라 환자들에게 효과적일 것으로 예상되는 맞춤 치료 방법을 탐색하였다. 이러한 접근은 폐선암 환자의 정밀의료를 위한 전략 개발의 기회를 제공하는 데에 그 의의가 있다. 두번째로, 우리는 유전체 데이터를 통해 폐암 PDX 모델의 효용 가치를 검증하였다. 효율적인 암 연구를 위해서는 종양의 이질적인 특성을 반영하는 전임상모델이 필요하다. 환자의 종양 조직을 면역결핍 마우스에 직접 이식하는 PDX 마우스 모델은 종래의 세포주 모델의 많은 한계를 극복할 수 있으며 환자 고유의 종양 이질성을 그대로 보유할 수 있다. 본 연구에서는 PDX 종양 샘플과 환자의 종양 및 정상 샘플이 있는 폐암 트리오 데이터 132쌍의 체세포 돌연변이를 비교 분석하였다. 우리는 환자와 PDX에서 공통적으로 나타나는 체세포 돌연변이를 분석하여 PDX가 환자의 체세포 돌연변이를 얼마나 충실히 재현하는지 확인하였다. PDX는 대체로 환자가 가진 돌연변이를 잘 재현하고 있었으며, 그 변이들은 PDX의 세대가 지나도 유지되었다. 특히 그 변이들 중에는 표적치료제의 타겟이 되는 유전자들도 포함되어 있었는데, 이는 PDX 모델이 개인화된 암 치료 전략에서 약물 스크리닝을 검증할 수 있는 모델이 될 수 있음을 시사한다. 세번째로 우리는 전사체 데이터를 이용하여 폐선암에서 종양 억제자 역할을 하는 TNNC1 유전자를 발굴하였다. 암의 정밀 진단을 위해서는 환자의 예후에 영향을 미치는 종양 유발 유전자나 종양 억제 유전자를 식별하는 것 또한 중요하게 여겨진다. 수많은 연구에 의해 많은 돌연변이와 차등 발현 유전자, 패스웨이의 변형들이 암의 진행과 발생에 관여한다고 알려졌으나 그 중에서도 핵심 역할을 하는 드라이버와 중요하지 않은 패신저를 구별하는 것은 중요하다. 우리는 자체 생산한 폐선암 환자의 전사체 데이터와 TCGA 폐선암 환자의 발현 데이터 분석을 통해 대부분의 폐선암 환자의 종양 조직에서 TNNC1의 발현이 정상 조직보다 낮아져 있는 것을 확인하였고, TNNC1이 종양 억제 유전자로 작용한다는 것을 발견했다. 패스웨이 활성화 점수의 분석을 통해 TNNC1이 세포 성장 억제와 세포 주기의 억류 및 DNA 손상 반응에 관여한다는 것을 확인했으며, 독립적인 두 세포주를 이용하여 이를 실험적으로 검증하였다. 또한 생존분석을 통해 낮아진 TNNC1의 발현이 환자의 나쁜 예후와 높은 관련이 있는 것을 확인하였다. 이는 TNNC1이 폐선암에서 예후 진단의 임상적 가치를 가지고 있음을 시사한다.