Studies on (1) the antiplatelet mechanism of action of a novel PPARγ agonist, KR-62980 and (2) the antithrombogenic role of peroxiredoxin II in hyperlipidemic state

Abstract

PART I. The peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are members of the nuclear receptor superfamily that act as transcription factors in a variety of tissues. PPARγ agonists are typical therapeutic agents of type 2 diabetes. Although platelets lack a nucleus, it has been reported that they express PPARs and many PPAR ligands inhibit platelet activation processes such as proinflammatory mediation, aggregation, and thrombosis. Patients with diabetes are at high risk for cardiovascular diseases, which is a major complication, and they are prescribed antiplatelet agents combined with antidiabetics. PPARγ agonists have been attracting attention because they can be expected to have simultaneously inhibitory effects on diabetic and platelet activation. In this study, the mechanism by which rosiglitazone inhibits collagen-induced platelet activation is newly identified at the molecular level. PPARγ is also present in the upstream signaling complex, which is associated with collagen receptor glycoprotein VI (GPVI), Lyn tyrosine kinase, Fc receptor γ-chain and Syk tyrosine kinase at the early stage of platelet activation after collagen binds to GPVI. Rosiglitazone inhibited the binding of PPARγ to this signaling complex and the autophosphorylation of tyrosine residues on Lyn, which is essential for the activation of Lyn. The next study demonstrated the antiplatelet effect of a novel PPARγ agonist, KR-62980 (1-(trans-methylimino-N-oxy)-3-phenyl-6-(3-phenylpropoxy)-1H-indene-2-carboxylic acid ethyl ester). Rosiglitazone has been classified as a prohibited drug because of its cardiotoxicity. Therefore, excluding the side effects of the thiazolidinedione compounds such as rosiglitazone, many studies have been conducted to develop non-thiazolidinedione compound as PPARγ agonist, and KR-62980 is also a product of these studies. KR-62980 inhibited the binding of PPARγ to upstream signaling complex in GPVI signaling pathway and the autophosphorylation of tyrosine residues on Lyn, which is critical for the activation of Lyn. In addition, KR-62980 inhibited platelet aggregation and adherence and intravascular thrombus formation in vivo animal model. In summary, (1) PPARγ has been shown to play a role in regulating the signal transduction system in anucleated platelets, (2) PPARγ has a great potential as a novel target for the development of antiplatelet agents that can prevent the formation of intravascular thrombus simultaneously with the treatment of diabetes, (3) KR-62980 should be further studied to be developed as a therapeutic agent expected to exhibit antidiabetic and antiplatelet effects at the same time. PART II. Atherosclerosis is characterized by plaque formation, resulting in the narrowing of the lumen of the artery. It is the primary cause of cardiovascular diseases including myocardial infarction, angina pectoris, cerebral ischemia, stroke, or even death. Platelet hyperactivity aggravates thrombus formation after atherosclerotic plaque rupture. It also promotes the inflammatory process of atherosclerosis. Reactive oxidative species (ROS) have been implicated in atherothrombosis in hypercholesterolemia via platelet activation. Therefore, the ROS-eliminating enzyme system is an important factor in redox-dependent platelet activation. Peroxiredoxin II (PrxII) is a cellular peroxidase that eliminates endogenous H_(2)O_(2) in various endothelial and immune cells. It has been reported to regulate proinflammatory responses, vascular remodeling, and global oxidative stress. Previous study has demonstrated that PrxII deficiency enhances atherosclerotic plaque formation in apolipoprotein E (ApoE)-deficient mice. In addition, PrxII-deficient platelets showed signs of hyperactivity when compared with wild-type platelets. These findings suggest that PrxII is an important downregulator of platelet reactivity and prothrombotic signals, and platelet-mediated inflammatory responses contribute to atherothrombosis in hyperlipidemia. In this study, PrxII deficiency accelerates thrombus formation in FeCl_(3)–induced carotid artery injury models in mice. Also, previous study showed that oxidized low density lipoprotein (oxLDL) formed in hyperlipidemia increases platelet reactivity in a CD36-dependent manner. Deficiency of PrxII in ApoE-deficient mice increased the plasma levels of oxLDL, but there was no change in total plasma cholesterol level. Then, deficiency of PrxII in ApoE-deficient mice resulted in increased platelets aggregation, adhesion and integrin α_(IIb)β_(3) activation, leading to thrombus formation. This study demonstrates that PrxII acts as a factor to prevent atherothrombosis-mediated vascular disease in hyperlipidemic state by inhibiting the oxidation of LDL to prevent the activation of platelets by oxLDL and suppressing thrombus formation via eliminating increased ROS when platelets are activated.;PART I. PPAR (Peroxisome proliferator-activated receptor)는 다양한 조직에서 transcription factor로 작용하는 nuclear receptor superfamily 중 하나이다. PPARγ agonist는 대표적인 제2형 당뇨병 치료제이다. 혈소판은 핵이 없는 세포이지만 PPAR가 발현되어 있고, PPARγ agonist인 rosiglitazone이 혈소판 활성화 억제 효과를 나타내는 것이 보고 되었다. 당뇨병 환자는 대표적 합병증인 심혈관계 질환에 대한 고위험군이어서 항혈소판제를 당뇨병 치료제와 함께 처방하는 비율이 매우 높은데, PPARγ agonist는 항당뇨와 항혈소판 효과를 동시에 기대할 수 있어 주목 받고 있다. 본 연구에서는 먼저 rosiglitazone이 collagen으로 활성화된 혈소판의 활성화를 억제시키는 기전을 분자수준에서 새로이 규명하였다. Collagen이 receptor인 glycoprotein VI (GPVI)에 결합하고 혈소판의 활성화가 진행되는 초기에 GPVI, Lyn tyrosine kinase, Fc receptor γ-chain, Syk tyrosine kinase 등이 함께 결합되어 있는 upstream signaling complex에 PPARγ도 존재하는데, rosiglitazone은 PPARγ가 이 signaling complex에 결합하는 것과 Lyn 단백질이 kinase 활성을 발휘하는데 핵심적인 Lyn 단백질 내 tyrosine 잔기의 autophosphorylation을 억제하였다. 다음 연구에서는 새로운 PPARγ agonist인 KR-62980 (1-(trans-methylimino-N-oxy)-3-phenyl-6-(3-phenylpropoxy)-1H-indene-2-carboxylic acid ethyl ester)의 항혈소판 효과를 입증하였다. Rosiglitazone은 심장 독성의 부작용이 보고되면서, 금지 약물로 지정되었던 적이 있다. 따라서, rosiglitazone과 같은 thiazolidinedione 계열의 화합물에서 우려되는 부작용이 배제된 다른 구조의 화합물을 PPARγ agonist로 개발하기 위한 많은 연구들이 진행되어 왔는데, KR-62980도 이러한 연구결과의 산물이다. KR-62980은 collagen으로 활성화된 혈소판에서 일어나는 GPVI signaling pathway에서 PPARγ가 upstream signaling complex에 결합하는 것과 Lyn 단백질이 kinase 활성을 발휘하는데 핵심적인 Lyn 단백질 내 tyrosine 잔기의 autophosphorylation을 억제하였다. 그리고, KR-62980이 이러한 작용을 통하여 in vitro에서 혈소판의 응집능과 부착능을 in vivo 동물 실험에서 혈관 내 혈전 형성까지도 억제하였다. 이상의 연구들을 종합하면, (1) PPARγ는 핵이 없는 혈소판에서 활성화 신호전달계를 조절하는 역할을 담당한다는 것이 확인되었고, (2) PPARγ는 당뇨병 치료제 개발과 동시에 혈관 내 혈전 형성을 예방할 수 있는 항혈소판제 개발을 위한 novel target으로서 큰 가능성이 있으며, (3) KR-62980이 항당뇨와 항혈소판 효과를 동시에 기대할 수 있는 치료제로 개발되기 위한 후속 연구가 필요하다고 사료된다. PART II. 고지혈증에서 혈소판이 과도하게 활성화되어 혈전 형성이 증가되는 것은 가장 중요한 특징이다. 고지혈증에서 나타나는 염증반응을 매개하는 다양한 세포들에 의해서 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생성이 증가되는데, 혈소판에서도 이러한 현상은 나타난다. 혈소판이 활성화되면 ROS 생성이 증가되며, 이는 혈소판의 활성을 증폭시키는 인자로 작용한다. 항산화 효소인 peroxiredoxin (Prx)은 ROS 중의 하나인 hydrogen peroxide를 제거하는 peroxidase 활성을 갖는다. Peroxiredoxin II (PrxII) 유전자 결손 마우스의 혈소판이 정상 대조군보다 활성 반응이 증가된다고 알려져 있다. 본 연구에서는 고지혈증과 관련하여 atherothrombosis를 증진시키는 작용을 하는 혈소판의 과도한 활성화와 혈소판이 매개하는 염증성 반응 등을 억제시키는 인자로서 PrxII가 중요한 역할을 담당하는 항산화 효소임을 apolipoprotein E-deficient (ApoE^(–/–)) 마우스와 PrxII and ApoE double-deficient (PrxII^(–/–)ApoE^(–/–)) 마우스를 이용하여 규명하였다. 고지혈증 상태에서 혈중에 증가되는 oxidized low density lipoprotein (oxLDL)은 혈소판의 세포막에 존재하는 수용체인 CD36에 결합하여 혈소판의 활성을 증가시키는 작용을 한다. PrxII^(-/-)ApoE^(-/-)는 ApoE^(-/-)에 비하여 혈중 내 cholesterol 수치는 변하지 않았으나, oxLDL 수치가 증가하였다. 마우스의 oxLDL이 포함된 혈장과 함께 분리한 혈소판을 ADP로 활성화시켰을 때, 혈소판의 응집능, 부착능, 혈소판 표면의 integrin α_(IIb)β_(3) 의 활성화가 ApoE^(-/-)에 비하여 PrxII^(-/-)ApoE^(-/-)에서 현저히 증가되었다. 또한, FeCl_(3)로 유도되는 경동맥의 혈전 형성도 ApoE^(-/-) 마우스에 비하여 PrxII^(-/-)ApoE^(-/-) 마우스에서 증가되는 것을 확인하였다. 본 연구를 통하여, PrxII는 혈소판이 활성화될 때 증가되는 활성산소를 제거함으로써 thrombus 형성을 억제시켜 고지혈증에서 atherothrombosis에 의한 혈관질환을 억제시키는 인자로 작용한다는 것을 규명하였다.