Development of potential anti-melioidosis agents targeting the heptose biosynthesis pathway using X-ray crystallography and electrospray ionization mass spectrometry

Abstract

지난 수십여 년 간 다제내성(multidrug resistance) 미생물들의 출현수가 급속하게 증가함에 따라, 미생물 감염으로 인한 질병이 심각한 공중보건문제로 대두되고 있다. 항생제 내성은 노인, 장기이식 환자, 항암제 투여환자와 같이 면역기능이 저하된 사람들의 침습적 시술 및 인공의료기구 사용을 포함하는 다양한 치료에 큰 장애가 되고 있다. 그 결과 감염환자들의 이환율(morbidity)과 사망률(mortality)이 크게 증가할 것으로 예상된다. 이러한 문제들을 극복하기 위하여 새로운 항생제 치료 타겟과 항생제 후보물질의 개발이 필수적이다. 유비저균(Burkholderia pseudomallei)은 유비저(melioidosis)의 원인균으로 다양한 항생제들에 대한 심각한 내성이 보고되고 있다. 또한 백신의 부재 및 높은 치사율로 미국에서 생물학무기로 간주되고 있다. 따라서 유비저균을 타겟으로 하는 새로운 항생물질 개발을 위한 연구가 시급하다. 종전 연구들에서 박테리아의 지질다당류(lipopolysaccharide)의 구성물질인 헵토오스(heptose) 합성에 관여하는 유전자들의 변이는 박테리아를 사멸시키거나 항생물질에 대한 민감도를 높여주고 숙주에 대한 감염능력을 상실하게 한다는 것이 알려졌다. 따라서 헵토오스 생합성 관련 단백질들은 새로운 항생제 물질 개발의 타겟이 될 수 있다. 본 연구에서는 항유비저제(anti-melioidosis agent) 개발을 위하여, 유비저균의 헵토오스 생합성 관련 단백질들과 이를 타겟으로 하는 항생물질 탐색 연구를 수행하였다. 이를 위하여 헵토오스 생합성에 참여하는 모든 효소들을 분리하였으며, X-선 결정학(X-ray crystallography)과 전기분무 질량분석법(electrospray ionization mass spectrometry)을 이용하여 몇몇 단백질들의 3차원 구조 및 분자적 특성을 규명하였고, HddC 단백질을 타겟으로 하는 새로운 항생제 후보물질을 발굴하였다. 먼저 유비저균의 HldC 단백질(D-glycero-β-D-manno-heptose-1-phosphate adenylyltransferase from B. psuedomallei, BpHldC)의 X-선 결정구조를 규명하였다. BpHldC는 뉴클레오티딜전이효소 중 하나로, ATP로 부터 AMP 부분을 기질인 D-glycero-β-D-manno-heptose-1-phosphate에 전달한다. BpHldC의 구조는 뉴클레오티딜전이효소의 구조적 특징 중 하나인 결합부위의 로스만 유사구조(Rossmann-like fold)를 가지며, 동종 단백질(homologous protein) 간에 보존되어 있는 T/HXGH 서열 모티프를 가지고 있다. 효소활성의 분자적 메커니즘 규명을 위하여 in silico 도킹을 통한 구조분석 연구를 수행하였다. 뉴클레오티딜전이효소에서 기질과 결합하여 효소활성에 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기들이 BpHldC의 구조에서도 위치적 보존되어 있으며 기질과 결합을 형성하고 있음을 확인하였다. 또한 C-말단의 알파 나선(α-helix) 구조의 유동성이 특징적으로 관찰되는데, 기질의 결합에 의한 C-말단 알파 나선의 구조적 변화가 효소활성에 중요한 역할을 할 것으로 추정된다. 다음으로 버크홀데리아 타일렌덴시스(Burkholderia thailandensis)의 GmhB 단백질(D-glycero-D-manno-heptose-1,7-bisphosphate phospha tase from B. thailandensis, BtGmhB)의 X-선 결정구조를 규명하였다. 버크홀데리아 타일렌덴시스는 유비저균과 매우 유사한 유전자 서열을 가지지만 인간에게 병원성이 없어 유비저 대신에 유비저 연구에 널리 사용되는 균주이다. BtGmhB는 haloacid dehalogenase superfamily 중 하나로 로스만 구조를 가지고 있다. 우리가 규명한 BtGmhB의 X-선 결정구조는 다른 동종 GmhB 단백질 구조가 단량체인 것과 달리 효소활성 및 구조유지에 중요한 두 개의 금속(Zn^(2+), Mg^(2+))이 결합되어 있지 않은 이황화결합으로 연결된 이량체(disulfide bonded dimer)이다. 일련의 생화학적 실험을 통하여 Zn^(2+) 결합부의 시스테인기의 산화가 결합부로부터 Zn^(2+)의 분리를 야기하며, 나아가 이량체 형성을 촉진하는 것을 밝혔다. 특이하게 in vitro 상태에서 BtGmhB는 단량체, 시스테인기를 통한 이량체와 그렇지 않는 이량체, 세 가지 형태가 모두 혼재한 상태로 존재한다. 단량체와 달리 두 형태의 이량체는 효소활성에 중요한 역할을 하는 Mg^(2+)의 결합부가 구조적으로 변형되어 효소 활성을 잃는다. 위치특이 돌연변이(site-directed mutagenesis) 실험을 통하여 두 형태의 이량체가 존재함과 이량체 형성에 Zn^(2+) 결합부위 시스테인의 역할을 증명하였다. 또한 서열이 매우 유사한 유비저균의 GmbB 단백질의 위치특이 돌연변이 실험과 서열비교분석을 통하여 BtGmhB의 이량체 형성 기제를 규명하였다. 마지막으로 본 연구에서는 헵토오스 경로 중 HddC 단백질을 타겟으로 하는 항생제 후보물질을 발굴하였다. 이를 위하여 유비저균의 헵토오스 생합성경로 관련 효소를 모두 분리하였고, 전기분무 질량분석법을 이용하여 그 효소들의 활성을 측정하였다. 또 헵토오스 생합성 기작에 필요한 모든 단백질들과 보조인자(cofactor)들을 혼합한 용액에 스크리닝 물질과 기질을 넣어 반응을 시작시킨 후, 최종산물의 생성여부를 판단하는 효과적인 스크리닝 방법을 이용하여 니아솔((-)-nyasol)을 헵토오스 생합성 경로 저해 항생제 후보물질로 도출하였다. 니아솔은 HddC의 뉴클레오티딜 전이효소활성에 대하여 저해활성을 보였으며, 17.8 μM의 IC50값을 나타냈다. 본 연구에서는 유비저균의 헵토오스 생합성 관련 단백질들의 X-선 결정구조와 분자적 특성을 규명하였으며, 전기분무 질량분석법을 이용하여 새로운 항생제 후보물질을 발굴했다. 본 연구의 결과와 접근법은 새로운 항유비저제의 개발에 이용할 수 있으며, 나아가 다양한 박테리아들의 생합성 경로 저해제 개발에 적용할 수 있을 것이다.;Development of new therapeutic targets and antibiotics has been required due to the rapid multidrug resistance increase. It is reported that inhibition of the heptose biosynthetic pathways decreases pathogenicity and increases sensitivity against antibiotics in some bacteria. Thus the heptose biosynthetic pathways can be good targets for designing novel antibiotics. Burkholderia pseudomallei, a causative agent of melioidosis, has been classified as a potential bioterrorism agent and exhibits extraordinary resistance to a variety range of antibiotics. Therefore, enzymes in the heptose biosynthesis pathways of B. pseudomallei were studied to find out the novel anti-melioidosis agents. In this thesis, whole enzymes in the heptose biosynthesis pathways from B. pseudomallei were purified and identified their enzymatic activities using electrospray ionization-mass spectrometry. Among them, the X-ray crystal structures and molecular properties of D-glycero-β-D-manno-heptose-1-phosphate adenylyltransferase from B. pseudomallei (BpHldC) and D-glycero-D-manno-heptose-1,7-bisphosphate phosphatase from B. thailandensis (BtGmhB) were determined. BpHldC is the fourth enzyme of the ADP-L-β-D-heptose biosynthesis pathway and transfers the AMP moiety from ATP to D-glycero-β-D-manno-heptose-1-phosphate. To explore the molecular mechanism of catalytic activity of BpHldC, in silico docking study with its substrates was carried out. It revealed that the conserved catalytic key residues in BpHldC homologues were involved in ligand binding. The structural analysis and comparison with its homologues showed that the conformational change of the C-terminal domain is essential in the catalytic function. BtGmhB is the second enzyme of both biosynthesis pathways for ADP-L-β-D-heptose and GDP-6dD-heptose. The crystal structure of BtGmhB revealed a dimeric form without catalytically important metal ions. This metal-free BtGmhB shows the importance of zinc and magnesium ions for both structural and functional reasons. Biochemical studies and mutant experiments were performed to investigate the unusual dimerization characteristics of BtGmhB. All enzymes identified were screened by approximately 160 compounds to find potential anti-melioidosis agents. One promising lead is (-)-nyasol targeting D-glycero-α-D-manno-heptose-1-phosphate guanylyltransferase (HddC) of B. pseudomallei. (-)-Nyasol exhibits the half maximal inhibitory concentration value of 17.6 μM. The crystal structures of BpHldC and BtGmhB can be used as the templates for protein structure-based drug design in drug discovery. A further study is going on using (-)-naysol derivatives to find better leads with high affinity. This approach is applicable to develop antibiotics targeting similar biochemical pathways.