Studies on Oxidation and Redox Regulation of Rho GTPases, RhoA

Abstract

RhoA, a representative member of the Rho GTPases, is known to regulate various cellular functions including cytoskeleton dynamics, cell adhesion and migration, and cell cycle progression. RhoA acts as a molecular switch regulating the activity by GTP and GDP binding cycle. Three protein classes regulating RhoA, Rho activating guanine nucleotide exchange factors (GEFs), deactivating GTPase-activating proteins (GAPs) and guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs), have been well studied, however, redox regulation of RhoA on structural and functional regulation are yet to be elucidated, although RhoA activity is regulated by reactive oxygen species (ROS). Based on previous findings of various oxidative modifications of RhoA in gastric cancer tissues, redox regulations of RhoA were investigated in vitro and in vivo. In order to understand the redox regulation of RhoA, recombinant RhoA WT and six well-conserved Cys mutants (C16A, C20A, C83A, C107A, C159A, C190A) were expressed in E. coli and purified under the anaerobic condition, because RhoA protein is very sensitive to oxygen in air and generated in promiscuous disulfide crosslinking. Disulfide formations and oxidative modifications of GTP- or GDP-RhoA WT and Cys mutants in response to H2O2 were well examined. GTP-RhoA is more sensitive to ROS than GDP-RhoA and the structural changes were studied by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS). Mutant C107A was found to have tendency to form dimers readily, while C190A mutant to form intra-disulfide bonds and Cys159 is important residue to maintain the protein stability because of low yield of C159A mutant protein. Of these six Cys residues, Cys190 has been identified as the most reactive Cys residue to ROS employing a reactive Cys specific chemical probe, NPSB-B, and six Cys residues are affecting each other for redox regulation. The oxidative modifications of RhoA in vitro and in vivo were identified by peptide sequencing with nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS combining with immunoprecipitation. Cys20 and Cys83 are important for generating intra-disulfide crosslinking and Cys16, Cys107, Cys190 for inter-disulfide bond. Structural analysis of RhoA depicts that the distances between Cys16, Cys20, Cys83, Cys159 are very close (<10 Å) to form the disulfide crosslinking, and intriguingly Cys107 and Cys190 are important to regulate the disulfide crosslinking of RhoA. The activation of RhoA in HeLa cells overexpressing RhoA and six Cys mutants was examined by measuring phospho-myosin light chain (pMLC) as a substrate of ROCK (Rho-kinase), downstream of active RhoA. The results show that Cys mutants having defect on inter-disulfide crosslinking, C16A, C107A and C190A, lost their activities. This present studies demonstrate that RhoA is very sensitive to ROS and regulated by oxidative modifications in six Cys residues in response to ROS. Although more detail regulation mechanism of RhoA should be further studied, these results suggest that oxidative regulation of RhoA can be a target of therapeutics of RhoA functioning in various diseases including cancer, inflammation or ischemia.;RhoA는 Rho GTPases의 대표격으로 cytoskeleton dynamics, cell adhesion, migration과 cell cycle progression 등 여러 기능을 조절하는 것으로 많이 알려져 있다. RhoA는 GTP나 GDP와 결합한 형태로 순환하면서 신호전달을 하고 있다. RhoA의 조절자로는 guanine nucleotide exchange factors (GEFs)이나 deactivating GTPase-activating proteins 그리고 (GAPs) guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) 등이 잘 알려져 있는 것에 반해 활성산소(reactive oxygen species, ROS)에 의한 조절이 밝혀졌음에도 세부 연구가 더 필요한 실정이다. 선행연구에서 위암환자의 암조직에서 RhoA의 여러 oxidative modification들이 발견한 것에 기반해 활성산소에 의한 RhoA의 조절을 in vivo와 invitro에서 연구를 수행하였다. RhoA의 작용을 알기 위해 wildtype과 cysteine을 alanine으로 치환한 mutant(C16A, C20A, C83A, C107A, C159A, C190A)들을 제조하였는데 RhoA가 호기성 환경에서 매우 민감하게 산화하여 disulfide를 형성하였기 때문에 혐기성 환경에서 정제하였다. 이 연구에서 RhoA가 GDP와 GTP결합 형태에 따라, 그리고 각 mutant에 따라 disulfide가 생성되는 패턴을 면밀히 관찰하였다. GTP와 결합한 RhoA가 GDP와 결합한 형태에 비해서 더 ROS에 예민하게 산화되는 것을 발견할 수 있었고 GDP와 GTP의 결합에 의한 구조적 변화를 hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS)를 이용해 분석하였다. 그 결과, C107A mutant는 다른 mutant나 wildtype에 비해 dimer를 더 잘 형성하는 경향성을 가짐을 볼 수 있는 반면에 C190A는 intradisulfide bond를 만드는 경향이 더 강한 것으로 나타났다. C159A mutant는 정제 yield가 매우 낮게 나왔는데, 이 점을 미루어 보아 159번 Cys는 구조의 안정에 중요하게 기여함을 알 수 있다. Reactive Cys에 특이적으로 결합하는 probe인 NPSB-B를 이용하여 RhoA의 여섯 개 cysteine 중 190번 cysteine이 ROS에 가장 민감하게 반응함을 알 수 있었으며 다른 cysteine들이 reactivity에 서로 영향을 주는 것을 관찰할 수 있었다. in vitro 와 in vivo에서 RhoA의 oxidative modification들은 nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem MS와 immunoprecipitation 기법을 이용하여 분석하였다. 그 결과, Cys20과 Cys83는 intra-disulfide crosslinking 형성에, 그리고 Cys16와 Cys107, Cys190은 inter-disulfide bond 형성에 중요하게 기여함을 알 수 있었다. RhoA의 구조분석에서는 Cys16, Cys20, Cys83, Cys159가 서로 매우 인접하게 위치하고 있으며(<10 Å) 충분히 disulfide를 형성할 수 있는 거리인 것을 확인할 수 있었다. 흥미로운 점은, 어느 정도 거리를 두고 있는 것으로 보이는 Cys107과 Cys190 또한 disulfide 형성에 중요하다는 것이다. RhoA의 활성을 관찰하기 위해 HeLa cell에서 각 wildtype과 mutant들을 과발현시켜 RhoA의 effector인 ROCK의 myosin light chain 2의 인산화를 보았다. 그 결과, inter-disulfide crosslinking에 이상을 보인 mutant C16A, C107A and C190A의 활성이 감소하거나 활성을 보이지 없었다. 이 연구를 통해 RhoA는 매우 산화에 민감하며 여섯 개의 cysteine이 긴밀하게 단백질의 활성에 영향을 주는 것을 볼 수 있었다. 추후 산화에 의한 조절에 대한 세부적인 연구가 진행된다면 RhoA는 암이나 염증, ischemia의 치료 타겟이 될 수 있을 것으로 전망된다.