Anticancer Activity of Nm23 Activator Small Molecules by Targeting Mitochondrial Dysfunction

Abstract

본 연구는 암 전이 억제제로 알려진 Nm23 activator 1 (NMac1) 과 그 유도체 화합물의 새로운 활성인 암 증식 억제와 그 메커니즘을 탐구한다. Nucleoside diphosphate kinase-A (NDPK-A, Nm23-H1, NME1)는 암 전이를 억제하는 단백질 중에 가장 최초로 발견되었다. NTP 말단의 고에너지 인산기를 NDP로 전달하는 NDP kinase 활성이 대표적인데, 이 활성을 통해 암 전이 억제에도 관여한다고 알려져 있다. 임상적으로도 암 전이 혹은 암환자의 예후와 Nm23-H1 발현량이 반비례한다는 사실이 다양한 암 환자들의 샘플에서 확인되면서, Nm23-H1 발현을 조절하여 암의 전이를 저해하려는 여러 연구가 이루어져 왔다. 그리고 AAV-Nm23-H1, cell permeable (CP)-Nm23-H1, Medroxyprogesterone acetate (MPA) 등을 활용하여 Nm23-H1 발현을 조절하려는 시도가 있었으나 생체 내 실험을 진행하기 적합하지 않거나 임상에서 유효성을 확인하지 못하는 등의 이유로 성공하지 못하였다. 따라서, 전이를 억제하는 데 기여하는 NDPK 활성을 더욱 증진시킴으로써 암 전이를 억제하려는 선행 연구가 이루어졌고 천연물 라이브러리 스크리닝을 통해 small molecule NMac1이 발견되었다. NMac1 의 작용 기전을 이해하기 위해 Nm23-H1의 구조-활성 조절에 대한 연구가 선행되었다. NDPK active hexamer 구조는 산화 스트레스에 의해 쉽게 inactive dimer 로 구조 변화가 일어나는데, 그 과정에서 Cys109을 둘러싸고 있던 C-말단의 구조가 크게 변화하면서 Cys109이 표면에 노출되고 산화가 진행된다. Cys109이 sulfenic, sulfinic acid 를 거쳐 sulfonic acid까지 산화되면 irreversibly inactive monomer 가 된다. NMac1 은 HDX-MS 및 표면 플라스몬 공명 (Surface plasmon resonance), in silico 분자 결합 분석을 통해 Nm23-H1 C-말단에 직접적으로 결합하고 hexamer 구조를 안정화시키는 것으로 확인되었다. 그리고 생체 외 실험에서 세포 증식에는 영향을 주지 않으면서 migration 및 invasion을 감소시켰으며, 생체 내 실험에서 원발 종양의 크기에 영향 없이 삼중 음성 유방암 모델의 암 전이를 유의하게 감소시켰다. 또한 NMac1 의 구조-활성 관계를 규명하여 활성에 핵심적인 역할을 하는 작용기를 중심으로 추가적인 유도체 물질들이 합성되었다. 이러한 일련의 선행 연구에서 NMac1 의 암 전이 억제 활성에 대해 밝혔다면, 이번 연구에서는 NMac1이 포도당이 없는 환경에서만 특이적으로 삼중 음성 유방암 세포인 MDA-MB-231의 증식을 저해하는 활성을 가진다는 사실을 규명하였다. 일반적으로 알려진 체내 혈중 포도당 농도는 4-6 mM 인데 반하여 암세포의 포도당 농도는 10배이상 낮은 것으로 알려져 있다. 따라서, 포도당이 고갈된 조건에서 암세포를 사멸시키는 NMac1 의 선택성은 암세포 선택성을 가질 수 있을 것으로 예측하고 해당 조건에서 결과가 도출되었다. xCelligence RTCA를 통해 확인된 암세포 사멸 조건을 이용하여, DNA microarray 및 metabolomics analysis 등의 결과 분석이 이루어졌다. NMac1은 포도당 고갈 조건에서 AMPK/mTOR/ERK의 signaling을 농도 의존적으로 변화시켰고 세포 내 ATP고갈을 초래하였으며 이는 complex I activity 억제를 통해 미토콘드리아 기능을 저해한 결과로 나타났다. 즉, OXPHOS가 모두 저해되어 있는 조건에서 포도당이 고갈되어 추가적인 ATP 보상이 이루어지지 못하기 때문에 암 세포 사멸로 이어진다고 해석될 수 있다. 한편, NMac1 유도체를 스크리닝하여 NMac1보다 낮은 농도에서 효과적으로 미토콘드리아 기능을 저해하는 화합물들이 선별 되었으며, 특히 NMac24는 가장 낮은 IC50값을 가지며 효과적으로 암 증식을 억제하는 것으로 확인되었다. 추가적으로, 기존의 생체 외 세포 실험은 monolayer 이므로 생체 내 실험과의 환경적 괴리가 있고 이러한 괴리를 줄이기 위해 생체 내 실험과의 유사성이 더 높다고 알려진 3차원적 세포 배양 방법을 이용해서, NMac1과 NMac24가 효과적인 증식 억제 활성이 있음을 다시 한번 확인하였다. 또한 기존에 complex I 활성 억제를 포함하여 암 증식을 억제한다고 알려진 biguanide 계열 약물인 metformin, phenformin 보다 NMac1, NMac24가 동일한 농도에서 훨씬 유효한 항암 활성을 보였다. 미토콘드리아는 세포 내 대부분의 ATP를 생성하는 소기관으로서 암세포가 성장하는 데에 매우 중요한 역할을 한다. 이러한 결과들은 NMac1이 기존의 암전이 효과와 더불어 포도당이 없는 환경 즉, 정상세포가 아닌 암세포 환경에서만 미토콘드리아의 기능장애를 통해 암 증식을 억제하는 물질로 새로운 가능성을 보여주고 있다. 종합해볼 때, NMac1과 NMac24는 추후 항암 치료의 후보 화합물로서 긍정적으로 검토될 수 있을 것으로 생각된다. ;Anti-cancer agents having both anti-metastatic and anti-proliferative activities specific for cancer cells are ideal for metastatic cancer therapy. Nm23-H1 activator 1 (NMac1), a small molecule phenylbutenoid dimer (±)-trans-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-[(E)-3,4-dimethoxystyryl]cyclohex-1-ene, has been identified as an anti-metastatic agent, because Nm23-H1, nucleoside diphosphate kinase-A (NDPK-A) or NME1, is the metastasis suppressor. In this study, NMac1 has been found to have anti-proliferative activity only in glucose depleted cancer environment, not in normal glucose levels in metastatic breast cancer cells. NMac1 causes significant activation of AMPK by decreasing ATP synthesis, lowers mitochondrial membrane potential (MMP, ∆Ψm), and inhibits oxygen consumption rate (OCR) under glucose starvation. These effects of NMac1 are provoked by a consequence of OXPHOS complex I inhibition. Through the structure-activity relationship (SAR) study of NMac1 derivatives, NMac24 was identified as the most effective compound in anti-proliferation. NMac1 and NMac24 effectively suppress cancer cell proliferation in 3D-spheroid in vivo-like models only under glucose starvation. These results suggest that NMac1 and NMac24 have the potential as anti-cancer agents having cytotoxic effects selectively in glucose-restricted cells. NMac compounds can be anti-cancer agents targeting the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), which has become an attractive target recently, as well as an anti-metastatic agent.