Tyrosine phosphorylation of OPN by an extracellular kinase VLK and Identifying potential substrates of a related secreted kinase DIA1

Abstract

Proteomic analyses suggest that approximately 25% of all secreted proteins contain phosphorylated tyrosine residues. We identified VLK (Vertebrate Lonesome Kinase, also known as PKDCC) as a first extracellular kinase. Several related proteins, including DIA1/C3orf58, have conserved residues important for kinase enzyme activity. VLK and DIA1 is localized to the ER-Golgi, and they are secreted from the cell. In previous study, we identified Osteopontin as a tyrosine phosphopeptide phosphorylated by VLK by LC-MS/MS. In part one, I attempted to verify VLK phosphorylates tyrosine 165 of OPN. I made mutant of Osteopontin which tyrosine 165 site was alternated to phenylalanine. Transfection of mutant OPN on VLK expressing cells decreased phosphorylation compared to wild type but did not completely disappear. Therefore, there are other sites besides tyrosine 165 and further investigation is necessary. According to previous study, OPN is glycosylated by GALNT2 regulated by VLK that OPN got smaller in VLK-AAAL expressing cells. To determine what causes the size change of OPN, GALNT2 mutant was created by mutating tyrosine 408 residue to phenylalanine that is presumed to be phosphorylated by VLK. As a result of co-transfection of GALNT2, OPN, mutants of GALNT2 and OPN in VLK-expressing cells, respectively, it did not affect the size change of OPN. Here I show VLK phosphorylates OPN and is not involved in O-glycosylation of OPN and further research is needed on the size change of the OPN in VLK-AAAL expressing cells. In part two, I attempted to identify potential substrates of DIA1 in order to understand the biological function of DIA1. DIA1 is highly expressed in AN3-CA cells, endometrial adenocarcinoma cells. DIA1 knockdown significantly reduced tyrosine phosphorylation of ER/Golgi and secreted proteins. Conversely, against our expectations, overexpression of wild type or kinase-defective mutant forms of DIA1, did not affect protein tyrosine phosphorylation. We isolated tyrosine-phosphorylated proteins from DIA1 knocked-down AN3-CA cells and expected to analyze them by mass spectrometry. Identifying DIA1 substrates will enhance our understanding of the scope of extracellular tyrosine phosphorylation and its biological significance.;티로신 인산화는 단백질 기능과 세포 메커니즘에 아주 중요하며 여러 질병들에 연관되어 있다. 여러 연구가 활발하게 진행되고 있지만 세포 외 단백질의 티로신 인산화에 대해서는 아직 생물학적 중요성과 역할이 잘 알려져 있지 않다. 우리 연구실에서는 2014년 VLK (Vertebrate Lonesome Kinase, PKDCC 라고도 함)라는 세포 외 티로신 인산화 효소를 첫 번째로 규명하였다. DIA1/C3orf58을 포함한 VLK와 연관된 여러 단백질들은 인산화 효소 활성에 중요한 잔기를 보존하고 있으며 아직 인산화 효소로서의 역할이 밝혀지지 않았다. 따라서 VLK와 DIA1의 기질을 찾아 세포 외 티로신 인산화와 그것의 생물학적 역할과 중요성에 대해 연구하고자 하였다. 1부에서 나는 VLK의 잠재적인 기질인 Osteopontin이 실제 VLK의 기질인지 확인하였다. 이전 연구에서 액체크로마토그래피-탠덤질량분석을 통해 OPN의 티로신 165가 VLK에 의해 인산화됨을 확인하였다. 나는 이 티로신 165 잔기가 페닐알라닌으로 대체된 돌연변이를 만들어 인산화가 감소하는 것을 확인하였다. 또한 VLK의 인산화 활성이 과발현된 VLK-AAAL 세포에서 OPN의 크기가 감소하는 것을 확인하고 이 원인이 무엇인지 연구하였다. 원인을 규명하기 위해 OPN과 마찬가지로 VLK의 기질임이 밝혀진 GALNT2의 글라이코실 전달 효소 활성이 OPN의 크기 변화를 조절하는지 연구하였다. OPN과 GALNT2, 그리고 VLK-AAAL의 동시전이연구를 통해 VLK가 OPN과 GALNT2를 인산화 하며 OPN의 글라이코실화는 조절하지 않는다는 것을 규명했다. 2부에서는 DIA1의 기질을 규명하고자 DIA1이 고도로 발현된 AN3-CA 세포에서 DIA1을 녹다운시켰다. 대조군에 비해 녹다운 세포에서 티로신 인산화가 유의미하게 감소한 것을 확인하였으며 이를 통해 DIA1이 세포 외 티로신 인산화임을 규명하였다. 나는 DIA1-녹다운 세포에서 티로신 인산화에 변화가 생긴 단백질을 분리하고 질량분석법으로 분석하여 DIA1의 잠재적 기질을 밝힐 것이다.