Enhancement of Bioremediation Performance of Diesel-Contaminated Soil Using Compost Amendment and Hydrocarbon-Degrading Bacteria

Abstract

Petroleum hydrocarbons are representative soil pollutants and can be treated effectively and environmentally friendly using bioremediation technology. The oil-contaminated soil technology with compost amendment and hydrocarbon-degrading microorganisms is an economical and eco-friendly treatment technology using biological metabolism. Compost can increase diesel degradation efficiency by supplying large amounts of nutrients and microorganisms to indigenous microorganisms. In addition, hydrocarbon-degrading microorganisms can generally produce biosurfactants and improve the bioavailability of pollutants. In this study, the effect of compost amendment on the diesel contamination soil bioremediation was investigated by evaluating diesel degradation efficiency (w/w), the enzyme activity of soil microorganisms, functional gene abundance, and bacterial community structure of diesel-contaminated soil with compost amendment (0-20%, w/w). In addition, strains with excellent hydrocarbon degradability in diesel-contaminated soil were isolated, and their hydrocarbon degradation characteristics were investigated. Also, functional gene abundance and bacterial community structure were analyzed to evaluate the behavior of strains in diesel-contaminated soil. In this study, barren soil with different compost amendment ratios (0, 5, 10, and 20%, w/w) was artificially contaminated with 20,000 mg-diesel·kg soil-1 to evaluate the effect of compost amendment on bioremediation performance. Compost amendment increased the diesel removal efficiency, and after 103 days, the removal efficiency of soil without compost and with 20% compost amendment was 54% and 85%, respectively. In addition, compost amendment increased the CH4¬ oxidation potential, and the 20% compost amendment soil had a 1.79 higher CH4 oxidation potential than that of soil without compost amendment. However, the N2O reduction potential of diesel-contaminated soil decreased over time, and there was no significant effect of compost amendment. Also, compost amendment affected the soil bacterial community structure dynamics, and the ratio of Immundisolibacter, Acidibacter, and Terrimonas increased as the amount of compost increased. To isolate bacteria with excellent hydrogen degradability, diesel-degrading consortiums of Maize and Tall Fescue rhizosphere contaminated with high concentration of diesel (10,000 mg·kg soil-1) was cultured. After then, Serratia sp. DM1 and Pseudomonas sp. DTF1 having excellent diesel removal ability were isolated. Both strains tested positive in hemolysis, lipase, microplate, and emulsification assay and produced biosurfactants. In addition, the DM1 strain and DTF1 strain had the alkB gene involved in alkane hydroxylase. To derive the optimal conditions for hydrocarbon decomposition of isolated strains, hydrocarbon degradation efficiency was evaluated under different types, concentrations, and culture conditions. DM1 and DTF1 strains could decompose lubricants oil and grow using pyrene, an aromatic hydrocarbon. DM1 had the highest diesel degradation efficiency at 25℃ and pH 7.0, while DTF1 had the highest diesel degradation efficiency at 30℃ and pH 8.0, respectively. DM1 strain could remove 74, 72, 38, and 65% of 5,000, 10,000, 20,000, and 30,000 mg-diesel·L-1 of diesel, respectively. DTF1 strain could remove 70, 82, 78, and 66% of 5,000, 10,000, 20,000, and 30,000 mg-diesel·L-1 of diesel, respectively. In addition, DM1 and DTF1 strains could improve diesel removal efficiency of diesel-contaminated soil. DM1 and DTF1 strains improved diesel removal efficiency of diesel-contaminated soil slurry 1.6 and 1.7 times, respectively, compared to the control group without inoculation. In particular, DTF1 removed 53-100% of C10-C26 n-alkane in the diesel-contaminated soil in 32 h. In addition, the DTF1 strain could remove 64% of diesel in the diesel-contaminated soil (10,000 mg-diesel·kg soil-1) in 27 days while (1) maintaining the functional gene (alkB) abundance involved in diesel degradation (~103), and (2) maintain the Pseudomonas ratio in bacterial community structure (>20%). On the other hand, the DM1 strain could remove 66% of diesel-contaminated soil 10,000 mg-diesel·kg soil-1) in 27 days and maintain the alkB gene abundance (~103). Therefore, the DM1 and DTF1 strains isolated in this study can be used in various types and ranges of hydrocarbon-contaminated soil bioremediation.;석유계 탄화수소는 대표적인 토양 오염물질로 생물정화기술을 이용하여 효과적이고 환경 친화적으로 처리할 수 있다. Compost 및 탄화수소분해 미생물을 이용한 유류오염토양 정화기술은 생물의 물질대사를 이용한 경제적이고 친환경적인 생물학적 처리기술이다. Compost는 토착미생물에 대량의 영양분과 미생물을 공급하여 디젤분해효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 탄화수소분해미생물은 대체로 생물계면활성제를 생성하여 오염물질의 생물가용성을 증가시킬 수 있으며, 디젤분해효율을 증가시킬 수 있다. 본 연구에서는 compost 첨가가 디젤오염토양 생물학적처리에 미치는 영향을 조사하고자 5-20% (w/w)의 compost를 첨가한 디젤오염토양의 디젤분해양상과 토양미생물의 효소활성, 기능성유전자 풍부도, 및 박테리아 군집분석을 수행하였다. 또한, 디젤오염토양에서 고분자 탄화수소 분해능이 우수한 균주를 분리하여 탄화수소 분해 특성을 조사하고, 디젤오염토양내 거동을 파악하기 위해 기능성 유전자 풍부도와 박테리아 군집구조를 조사하였다. 본 연구에서는 compost 첨가가 생물정화 성능에 미치는 영향을 평가하기 위해 퇴비 비율 (0, 5, 10, 및 20%, w/w)이 다른 척박한 토양을 20,000 mg-diesel·kg soil-1로 오염시켰다. 퇴비 첨가는 디젤제거효율을 증가시켰으며, 103일 경과 후 퇴비를 첨가하지 않은 토양과 20% compost를 첨가한 토양의 제거효율은 각각 54, 85%였다. Compost 첨가는 메탄산화잠재능을 증가시켰으며, 20% compost 첨가 토양은 대조군에 비해 1.79배 높은 메탄산화잠재능을 가졌다. 그러나 시간 경과에 따라 디젤오염토양의 아산화질소환원잠재능이 감소하였고, compost 첨가에 따른 유의미한 효과는 없었다. Compost 첨가는 토양박테리아 군집구조에 영향을 미쳤으며, 첨가량에 따라 Immundisolibacter, Acidibacter, 및 Terrimonas의 비율이 증가했다. 탄화수소분해능이 우수한 박테리아를 분리하기 위해 고농도 디젤 (10,000 mg·kg soil-1)로 오염된 옥수수 및 톨페스큐 근권 토양내 디젤분해미생물 컨소시움을 농화배양하였다. 이후, 디젤제거능이 우수한 Serratia sp. DM1과 Pseudomonas sp. DTF1을 분리했다. 두 균주는 hemolysis, lipase, microplate 및 emulsification assay에서 모두 양성 반응을 보이며 생물 계면활성제를 생성할 수 있었고, alkane hydroxylase에 관여하는 alkB 유전자를 보유하였다. 분리 균주의 탄화수소 분해를 위한 최적 조건을 도출하기 위해, 탄화수소 종류, 농도 및 배양 조건을 달리한 조건에서 탄화수소 분해효율을 평가했다. DM1과 DTF1균주는 윤활유를 분해할 수 있었고, 방향족 탄화수소인 pyrene을 이용하여 생장할 수 있었다. DM1과 DTF1 균주의 디젤분해효율은 각각 25℃, 30℃와 pH 7.0, pH 8.0에서 가장 높았다. 5,000, 10,000, 20,000, 30,000 mg-diesel·L-1에서 24시간 배양 후 디젤 분해율을 비교한 결과, DM1 균주 접종시 제거효율은 74, 72, 38 및 65%였고, DTF1 접종시 분해율은 70, 82, 78 및 66%이었다. 10,000 mg-diesel·L-1로 오염된 토양에 분리 균주를 접종하면 정화효율이 향상됨을 확인하였다. 또한, 10,000 mg-diesel·L-1로 오염된 토양 슬러리에 DM1과 DTF1균주를 접종한 결과, 대조군 (무접종) 대비 디젤 분해효율이 각각 1.6와 1.7배 향상되었다. 특히, DTF1 균주는 32시간만에 디젤오염토양내 C10-C26 n-alkane을 53-100% 제거하며 고분자 탄화수소에 대해 우수한 제거능을 가지는 것을 확인했다. 또한, DTF1 균주는 27일간 디젤오염토양 (10,000 mg-diesel·kg soil-1)내 64%의 디젤을 제거하는 동시에 (1) 디젤분해에 관여하는 기능성유전자인 alkB abundance를 103 수준으로 유지시킬 수 있었으며, (2) 미생물 군집내 Pseudomonas bacteria 비율을 20%으로 유지할 수 있었다. DM1 균주는 27일간 디젤오염토양 (10,000 mg-diesel·kg soil-1)내 디젤을 66% 제거할 수 있었으며 디젤분해에 관여하는 기능성 유전자인 alkB abundance를 103 수준으로 유지시킬 수 있었다. 따라서 본 연구에서 분리한 DM1과 DTF1 균주는 다양한 종류와 범위의 유류오염토양 생물정화기술에 활용 가능함을 알 수 있었다.