Functional and Structural Studies on Calcium-binding Protein Secretagogin in Insulin Secretion

Abstract

Secretagogin (SCGN), a recently cloned calcium binding protein having six EF-hands, is selectively expressed in pancreatic β cells and neuroendocrine cells. Previous studies suggested that SCGN enhances insulin secretion by functioning as a Ca2+ sensor protein, but the underlying mechanism has not been elucidated. This study explored the mechanism by which SCGN enhances glucose-induced insulin secretion in both NIT-1 insulinoma cells and mouse primary islet cells. To determine whether SCGN influences the first or second phase insulin secretion, the kinetics of insulin secretion was analyzed in SCGN depleted NIT-1 cells. Silencing SCGN suppressed the second phase insulin secretion induced by glucose and H2O2, but not the first phase induced by KCl stimulation. Recruitment of insulin granules in the second phase of insulin secretion was significantly impaired by knocking down SCGN in NIT-1 cells. In addition, actin cytoskeleton was found as a novel interacting protein of SCGN in the plasma membrane and remodeling process of actin was regulated by SCGN in a glucose dependent manner. Since actin dynamics is known to regulate focal adhesion, a critical step in second phase insulin secretion, the effect of silencing SCGN on focal adhesion molecules including FAK and paxillin, and cell survival molecules, ERK1/2 and Akt was tested. Glucose and H2O2-induced activations of FAK, paxillin, ERK1/2 and Akt were significantly blocked by silencing SCGN. In order to investigate how SCGN as a Ca2+ sensor protein is regulated in molecular level by calcium binding, the structural changes of SCGN in response to calcium binding were explored in this study. When SCGN binds with calcium ion, dimeric SCGN having disulfide linkage was readily generated in the presence of calcium. Dimeric disulfide linkage was turned out as Cys193-Cys193 linkage by peptide sequencing with nanoUPLC-q-TOF tandem mass spectrometry combining disulfide searching algorithm Dbond. Calcium binding to EF-hands induced the optimization of redox sensitivity at Cys193 residue and then the formation of stable dimer of SCGN. To explain the calcium induced regulation of redox sensitivity, structural changes occurred by calcium binding were determined employing hydrogen/deuterium exchange monitored by mass spectrometry (HDX-MS). HDX-MS results indicate that calcium binding in EF-hands of SCGN induced significant structural changes of N-terminal region with increased surface exposure and flexibility, which affects the redox sensitivity of Cys193 residue. To confirm the role of N-terminal region in regulating the redox sensitivity, disulfide formation in a mutant of N-terminal truncated SCGN was examined. It was found that N-terminal truncation abolished the calcium effect on redox sensitivity of Cys193 and dimer formation. To elucidate whether these structural changes affect the biological function of SCGN, cellular function of SCGN on actin binding and insulin secretion in response to glucose were measured in pancreatic β cell overexpressing SCGN dimerization mutant. The results suggest that calcium induced dimer formation of SCGN is indispensable for SCGN function on insulin secretion. These results clearly demonstrate that the crosstalk between calcium binding and oxidative disulfide formation is a critical process for regulating SCGN function: calcium binding in EF-hands caused allosteric structural changes in N-terminal, which promotes ROS-induced dimerization through regulating redox sensitivity of reactive cysteine residue. On the basis of these observations, the present study suggests that SCGN is important for the proper regulation of glucose-stimulated insulin secretion through conformational changes induced by calcium binding and dimerization and thus a potentially useful target for treatment of some forms of type 2 diabetes.;Secretagogin (SCGN)은 최근에 밝혀진 6개의 EF-hand를 가진 칼슘결합단백질로 췌장 베타세포와 신경분비세포에 특이적으로 발현되어있다. 기존 연구들에서 SCGN이 칼슘인지단백질로 작용하여 인슐린 분비를 강화할 것으로 제시하였으나 그 작용 기전은 알려져 있지 않았다. 본 연구에서는 NIT-1 인슐린종 세포와 쥐의 췌장 세포를 사용하여 SCGN이 어떠한 기전으로 포도당에 의한 인슐린 분비를 조절하는지 연구하였다. 먼저 SCGN이 이상성 분비로 일어나는 인슐린분비 과정 중 어떤 과정에 영향을 미치는지 알아보기 위해 SCGN의 발현을 감소시킨 세포에서 시간에 따른 인슐린 분비 양상을 관찰하였다. 그 결과 SCGN의 발현을 감소시켰을 때, 포도당이나 과산화수소에 의해 시간이 지남에 따라 점차적으로 발생하는 제 2상 인슐린 분비는 억제되었으나 염화칼륨에 의해 초기에 빠르게 나타나는 제 1상 인슐린 분비는 영향을 받지 않음을 발견하였다. 또한 제 2상 인슐린 분비를 일으키기 위해 세포 내부에 저장된 인슐린이 세포막 근처로 이동하는 과정이 SCGN 발현의 감소에 의해 저해되는 것을 확인하였다. SCGN이 제 2상 인슐린 분비를 조절하는 기전을 밝히기 위해 세포내의 SCGN 결합 단백질을 조사한 결과, SCGN의 새로운 결합 단백질로 세포 골격을 구성하는 actin 단백질을 발견하였다. SCGN은 세포막 근처에서 actin 단백질과 결합하여 포도당 자극에 의해 일어나는 actin 단백질의 재구성을 조절하였다. 기존 연구를 통해 이러한 actin 단백질의 변화가 2차적 인슐린 분비에서 중요한 역할을 하는 세포와 기질 사이의 초점접촉에 영향을 준다는 것이 알려져 있으므로 FAK, paxillin과 같은 초점접촉 단백질과 그 하위단계의 매개 단백질로 세포의 생존을 조절하는 단백질인 ERK1/2, Akt에 대한 SCGN의 영향을 확인하였다. 그 결과 포도당과 과산화수소에 의한 FAK, paxillin, ERK1/2, Akt의 활성화 정도가 SCGN의 발현 감소로 인해 현저하게 저해되는 것을 관찰하였다. 한편, 본 연구에서는 SCGN이 칼슘인지단백질로서 칼슘 결합에 의해 어떻게 조절되는지 알아보기 위해 칼슘 결합에 의한 SCGN의 구조적인 변화를 분자 수준에서 연구하였다. SCGN이 칼슘과 결합하면 이황화물 결합을 지닌 SCGN 이합체의 형성을 강화시키는 현상을 발견하였고 Dbond 알고리즘을 접목시킨 nanoUPLC-q-TOF 이중 질량분석법을 통한 펩타이드 분석법을 이용해 이합체의 이황화물 결합이 Cys193-Cys193 사이의 결합임을 밝혔다. 또한 SCGN의 EF-hand에 대한 칼슘 결합이 Cys193의 산화환원에 대한 민감성을 적정수준으로 조절하여 안정적인 이합체가 형성될 수 있도록 돕는다는 것을 알 수 있었다. 칼슘 결합에 의한 구조적 변화를 관찰하기 위해 질량분석법을 이용한 수소/중수소 치환법을 사용하였다. 그 결과 칼슘 결합에 의해 SCGN의 아미노 말단 부분이 표면으로 노출되고 더 유연한 구조를 이루게 되는 것을 확인하였다. 이러한 칼슘 결합에 의한 아미노 말단 부분의 변화가 이합체 형성에 실제로 영향을 주는지 확인하기 위해 아미노 말단을 절단한 SCGN을 이용하여 이황화물 형성을 관찰한 결과 아미노 말단을 절단하면 이합체 형성과 Cys193의 산화환원 민감도를 조절하는 칼슘의 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 다음으로 이와 같은 구조적인 변화가 SCGN의 기능에 중요한 역할을 하는지 알아보기 위해 Cys193을 Ser으로 치환시켜 이합체를 형성하지 못하는 SCGN을 췌장 베타세포에 과발현 시킨 다음 SCGN과 actin의 결합 및 포도당 자극에 의한 인슐린 분비를 측정하였다. 그 결과 칼슘에 의한 SCGN 이합체의 형성이 인슐린 분비를 조절하는 SCGN의 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 칼슘 결합과 산화적 이황화물 형성의 상호작용이 SCGN의 기능에서 필수적인 과정임을 분명하게 보여준다. 즉, SCGN EF-hand에서의 칼슘 결합이 아미노 말단의 구조적인 변화를 일으키고 Cys193의 산화적 민감도를 조절하여 활성산소종에 의한 이합체 형성을 촉진시킨다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구를 통해 SCGN이 칼슘 결합에 의해 구조적인 변화를 일으키고 이합체를 형성하여 포도당 자극에 의한 인슐린 분비를 조절하는 것에 필수적인 역할을 한다는 것을 밝혔고 SCGN이 특정한 형태의 제2형 당뇨병의 치료에 있어 중요한 표적 단백질이 될 수 있음을 입증하였다.