Development of Three-arm Junction Nucleic Acid Nanostructures for Programmable Gene Regulation

Abstract

Small interfering RNA (siRNA) is a synthetic RNA duplex designed to specifically target mRNA for inhibition of protein expression. In 1998, Andrew Fire and Craig Mello first discovered the mechanism of RNA interference (RNAi), which was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006. Since then, various approaches have been attempted to develop siRNA as a therapeutic agent. One of the main drawbacks of siRNA is their delivery. siRNA is susceptible to nucleases and is rapidly eliminated due to its small size. Therefore, nanocarrier formulation and ligand conjugation are the two main strategies for delivering siRNA to target cells. Currently, the FDA has approved Oxlumo(lumasiran) as the third RNAi treatment, following Onpattro(patisiran) and Givlaari(givosiran). Nucleic acid structures are used endogenously as gene regulators in living cells. Synthetic nucleic acid-based nanostructures can provide several advantages as novel nanocarriers with compact and precise size, ease of chemical modification, and multivalent properties for various conjugations. This is particularly attractive to biomedical and diagnostics applications. Three-dimensional DNA and RNA nanostructures are programmed to self-assemble into defined size and shape. Their high degree of structural homogeneity provides more uniform pharmacokinetic profiles as compared to that of lipid and polymeric nanoparticles. Previously, self-assembled DNA nanostructures have been developed as drug delivery carriers due to their well-defined structures and facile preparation. However, the preparation of DNA nanostructures often requires several long lengths of synthetic DNA strands, which is very costly to utilize in practical applications. Chapter I reports the development of a large-scale synthesis of three-arm junction DNA nanostructures (Y-DNA) for siRNA delivery. A large-scale production of Y-DNA has been achieved by enzymatic synthesis using rolling circle amplification (RCA). Further, siRNA can hybridized with sticky overhangs of Y- DNA. Y-DNA hybridized with folic acid (FA) conjugated-siRNAs showed enhanced cellular uptake as well as dose-dependent in vitro gene silencing effect. In addition, RNA nanostructures have emerged as a novel platform for the intracellular delivery due to its unique physiochemical property and biological function. Chapter II reports development of Dicer substrate three-arm junction RNA nanostructures (Y-RNA) for enhanced RNAi potency. Gene silencing effect of Y-RNA can be achieved by inserting siRNA sequences into each arm of Y-RNA. Through structural optimization of the arm of Y-RNA, Y-RNA is carefully designed to recognize as Dicer substrate RNA. In addition, a large-scale enzymatic synthesis of Y-RNA was developed using rolling circle transcription (RCT) and site-specific cleavage. Depend on the cleavage site of various helper, seven form of Y-RNA can be produced from a single DNA template for programmable gene silencing effect. Although Y-RNA is an alternative gene silencing agent, chemical modification of Y-RNA is necessary for its use in clinical applications as RNAi therapeutics. Y-RNA interacts with RLC components such as TRBP, Dicer, and Ago2 in the endogenous RNAi pathway. Therefore, excessive modification of Y-RNA rather reduces RNAi potency. Chapter III reports development of a universal chemical modification for Y-RNA by considering protein-RNA interactions. The position-specific chemical modification of Y-RNA did not interfere with binding to the RLC components. In addition, it offered the enhancement of serum stability and in vivo gene silencing effect. Collectively, our results showed the versatile potential of there-arm juction nucleic acid nanostructures and this appraoch may offer new strategies to develop future RNAi therapeutics. ;작은 간섭 RNA (siRNA)는 단백질 발현 억제를 위해 mRNA를 특이 적으로 표적화하도록 설계된 합성 RNA 이중체이다. 1998 년 Andrew Fire와 Craig Mello는 RNA 간섭 메커니즘 (RNAi)을 처음 발견하여 2006 년 노벨 생리 의학상을 수상했다. 이후 siRNA를 치료제로 개발하기 위한 다양한 접근법이 시도되었다. siRNA는 크기가 작아 핵산분해효소에 민감하며 생체 내에서 빠르게 제거되기 때문에 세포 내 전달이 어렵다. 따라서 나노입자 제형과 타겟 리간드 접합은 siRNA를 표적 세포에 전달하기 위한 주요 전략이다. 현재 FDA는 Onpattro (patisiran), Givlaari (givosiran)에 이어 세 번째 RNAi 치료제로 Oxlumo (lumasiran)를 승인했다. 세포 내에서 핵산 구조체는 유전자 조절자 역할을 한다. 새로운 나노입자 운반체로서, 합성 핵산기반 나노구조체는 정확한 크기 조절, 화학적 변형의 용이성 및 다양한 접합을 통한 다양한 기능을 부여할 수 있는 장점이 있다. 3차원 DNA 및 RNA 나노구조체는 상보적인 가닥간의 결합을 통해 미리 결정된 크기와 모양으로 자가 조립될 수 있다. 이를 통해 기존의 지질 및 고분자 나노 입자에 비해 더 균일 한 약동학적 특성을 보인다. 이를 이용한 자가조립 DNA 나노구조체는 약물 전달체로서 개발이 활발히 진행되었다. 그러나 DNA 나노구조체를 제조하기 위해서는 긴 길이의 DNA 가닥이 필요하지만 이를 합성하기 위해서는 큰 비용이 요구된다. 1 장에서는 siRNA 전달체로 이용 가능한 삼중접합 DNA 나노구조체 (Y-DNA)의 대규모 합성 개발에 대해 다루었다. Y-DNA의 대규모 생산은 회전환 증폭을 이용한 효소 합성에 의해 이루어진다. 또한 효소적으로 합성된 Y-DNA의 말단부위에 존재하는 돌출 가닥은 siRNA와 혼성화 가능하다. 타겟 리간드인 엽산이 접합 된 siRNA와 혼성화 된 Y-DNA는 세포 내 축적이 향상되었으며, 용량 의존으로 유전자 침묵을 유도하였다. 또한 RNA 나노구조체는 고유한 물리화학적 특성과 생물학적 기능으로 인해 세포 내 전달을 위한 새로운 플랫폼으로 부상했다. 2 장에서는 RNAi 효능을 향상시키기 위한 Dicer 기질 삼중접합 RNA 나노구조체(Y-RNA)의 개발에 대해 다루었다. Y-RNA의 유전자 침묵 효능을 유도하기 위해 각각의 arm 부분에 siRNA 서열을 도입하였고, Dicer 기질 RNA로 인식되도록 Y-RNA는 구조적으로 최적화되었다. 또한 RNA 나노구조체 제조를 위해 회전환 전사 및 위치 특이적 절단을 사용하여 Y-RNA의 대량 효소 합성 방법을 개발하였다. 사용되는 헬퍼의 절단 부위에 따라 프로그램 가능한 유전자 침묵을 유도할 수 있으며, 단일 DNA 템플릿에서 7 가지 형태의 Y-RNA를 합성할 수 있다. Y-RNA는 기존 siRNA를 대체할 수 있는 유전자 침묵제이다. 이를 RNAi 치료제로 개발하여 임상에 적용하기 위해선 Y-RNA의 화학적 변형이 필수적이다. Y-RNA는 Dicer 기질로서 세포 내 RNAi 경로에서 TRBP, Dicer 및 Ago2와 같은 RLC 구성요소와 상호 작용한다. 따라서 Y-RNA의 과도한 화학적 변형은 오히려 RNAi 효능을 감소시킬 수 있다. 3 장은 단백질과 RNA의 상호 작용을 고려하여 Y-RNA에 보편적으로 적용할 수 있는 화학적 변형의 개발에 대해서 다루었다. Y-RNA의 위치 특이적 화학적 변형은 RLC 구성 요소에 대한 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 확인 되었다. 또한 이는 Y-RNA의 혈청 안정성을 향상시켰고 체내 유전자 침묵 효능을 강화하였다. 이 논문을 통해 삼중접합 핵산 나노구조체가 산업계에서 다양하게 적용될 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 증명하였다.