A Modified Helper Phage to Improve the Selection of Antibodies by Phage Display

Abstract

파지 디스플레이(phage display)는 펩타이드, 항체절편, 기타 스캐폴드 등 기능성의 결합 단백질을 거대한 라이브러리로부터 도출할 수 있는 강력한 방법이고, 특히 완전 인간항체를 선별하는 데 널리 활용되고 있다. 이러한 장점에도 불구하고, 파지 디스플레이의 잘 알려진 한계점 중 하나는, 일반적인 파지미드와 보조 파지 시스템을 사용할 경우 결함이 있는 서열을 가져서 디스플레이 하지 못하고 결합도 하지 못하는 클론들이 때로는 실제로 결합하는 클론보다 빨리 자라고 더 잘 증폭된다는 것이다. 이러한 문제점에 대한 해결책 중 하나는 보조 파지를 조작하여, pIII와 융합된 단백질을 적절하게 디스플레이하는 파지만 감염력을 가질 수 있도록 하는 방법이다. 본 연구에서, VCSM13의 유도체인 W181A 돌연변이 보조파지를 보고한다. 이 돌연변이 보조파지는 pIII의 N2 도메인에 있는 아미노산 하나(W181)를 치환하여 만들어졌다. 이 돌연변이는 파지의 감염력을 크게 감소시켰으며, 감소된 감염력은 야생형 gIII를 외부에서 도입해 줌으로써 회복될 수 있었다. W181A 돌연변이 보조 파지는 야생형 VCSM13과 유사하게 1011 cfu/mL 수준에서 생산될 수 있었다. 돌연변이 보조파지 DNA와 야생형 gIII가 공동 트랜스폼 된 TG1 대장균으로부터 제조된 W181A는 scFv 유전자를 가진 파지미드를 레스큐하고, 야생형 pIII가 융합된 정상적인 scFv 클론에만 감염성을 부여하는 반면, scFv를 디스플레이하지 못하여 돌연변이 pIII만을 가지는 클론은 훨씬 낮은 감염성을 가지게 만들었다. 더 나아가서 두 개의 합성 인간항체 라이브러리(OPALT-F와 sdAb)가 구축되었고, W181A와 VCSM13 보조 파지를 이용하여 레스큐되어 여러 개의 항원에 대하여 패닝이 진행되었다. ELISA와 서열분석 결과 W181A는 결합클론 및 기능적 서열의 비율 측면에서 야생형 VCSM13과 동등하거나 더 향상된 결과를 나타내었다. 결론적으로, W181A 돌연변이 보조 파지는 타겟 특이적 결합단백질을 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별하고 증폭하는 효율을 개선시킬 수 있었으며, 항체 도출이 어려운 도전적 표적분자에 대한 항체의 선별에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

;Phage display is a powerful method to isolate functional binding proteins such as peptides, antibody fragments, and other scaffolds from large libraries, and especially widely utilized in the selection of fully human monoclonal antibodies. Nevertheless, a well-known limitation of phage display employing common phagemid and helper phage system is that non-displaying, non-binding clones encoding defective insert sequences can sometimes outgrow true binders and preferentially amplified. One of the solutions to these problems is to engineer the helper phage used in phage display selection so that only the virions which properly display the pIII-fused protein can be infective. In this study, several modified versions of VCSM13 helper phage, including VCSM13∆N1 with truncated gIII and four mutants in N2 domain (W181A, F190A, F194A, F190A-H191A), are reported. Among these VCSM13 variants, the mutant helper phage constructed by mutating a single amino acid residue (Trp 181) in the N2 domain of pIII to alanine (W181A) showed best performance in term of productivity and infection titer. The mutation significantly reduced the infectivity of the phage, which could be rescued by an exogenous source of wild-type gIII. The mutant helper phage W181A could be produced to a level comparable to the wild type VCSM13 (~1011 cfu/mL). The W181A produced from TG1 E.coli by the co-transformation of the mutant helper phage DNA and the wild type gIII could rescue scFv-encoding phagemids and confer a high level of infectivity only to the full-length scFv clone fused to the wild type pIII, while making non-displaying clones with only the mutant pIII significantly less infective. Moreover, two human synthetic antibody libraries (OPALT-F and sdAb) in pComb3F phagemid vector were constructed, and rescued and panned against a number of antigens using the mutant helper phage W181A and the wild-type helper phage VCSM13. The ELISA and sequencing results demonstrated that W181A yielded comparable or superior results to the wild-type VCSM13 in terms of the percentages of binders and functional sequences among output clones. In conclusion, the mutant helper phage W181A showed improved efficiency of amplifying target-specific binders from phage display libraries, and could be utilized in the generation of antibodies against challenging targets.