PARP1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation of BAP1 tumor suppressor in UV-induced DNA damage repair and cancer cell survival

Abstract

BRCA1-associated protein 1 (BAP1), a nuclear deubiquitinating enzyme, functions as a tumor suppressor and the gene encoding BAP1 is frequently deleted or mutated in numerous human cancers, such as mesothelioma, melanoma, and renal cell carcinoma. BAP1 has roles in various cancer-associated cellular processes, including maintenance of genome stability. Although BAP1 promotes DNA double-strand break (DSB) repair, whether BAP1 functions in other types of DNA repair, such as nucleotide excision repair (NER), remain unknown. In addition, despite the high frequency of BAP1 mutations in many cancers, the mechanisms by which these cancer mutations contribute to tumorigenesis remain largely unknown. A recent study showed that BAP1 interacts with poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) following UV irradiation and promotes the repair of UV-induced DNA damage. Here, I investigated the potential role of PARP1-mediated PARylation in the BAP1 activity for UV-induced DNA damage repair and its ability to suppress cancer cell proliferation. First, I demonstrated that PARP1 poly(ADP-ribosyl)ates (PARylates) BAP1 and this PARP1-mediated BAP1 PARylation increases in response to UV irradiation. BAP1 PARylation after UV irradiation is transient and dose dependent. In vitro PARylation reaction combined with LC-MS/MS revealed that PAPR1 PARylates BAP1 at multiple sites, including several sites that are mutated in various human cancers, particularly Glu-30 and Glu-31 mutated with high frequency in renal cell carcinoma (RCC) and melanoma.Importantly, an individual mutation of those two amino acid residues to Ala, non-PARylatable amino acid, greatly reduces the stability of BAP1 via ubiquitin-mediated proteasomal degradation, suggesting that these amino acid residues promote BAP1 stability possibly via a crosstalk between PARylation and ubiquitination. In addition, Glu-31 is critical for the BAP1 activity to repair UV-induced DNA damage. More importantly, the E31A mutation compromises the ability of BAP1 to reduce the viability of two RCC cell lines, UMRC-6 and KMRC-20, which lacks BAP1 and expresses BAP1 with a mutation at Glu-31, respectively. The defect of the E31A mutant is not rescued even if expressed to the levels compatible to wild-type BAP1, suggesting that Glu-31 contributes to the BAP1’s activity to reduce the cancer cell viability not just by promoting protein stability but likely via PARylation. These results suggest that PARP1-mediated PARylation stabilizes BAP1 via a crosstalk with ubiquitination and possibly can promote the BAP1 activity against cancer cell proliferation via mechanisms other than regulating protein stability.;BAP1은 종양억제자 역할을 하는 탈유비퀴틴화 효소로, BAP1을 암호화하는 유전자는 흉막중피종, 흑색종 및 신장세포암을 포함한 수많은 인간 암에서 빈번하게 돌연변이 되어있다. BAP1은 유전체 안정성 유지와 같은 발암과 관련된 다양한 생물학적 과정에서 기능하는데, BAP1이 DNA 이중가닥 절단 (DSB) 복구를 촉진한다는 사실은 이미 알려져 있지만, 뉴클레오타이드 절단 복구(NER)와 같은 다른 유형의 DNA 손상 복구에도 관여하는지에 관해서는 아직 밝혀지지 않았다. 게다가 다양한 암에서 높은 빈도의 BAP1 돌연변이가 발견되고 있음에도 불구하고 이러한 돌연변이들이 종양 형성에 기여하는 메커니즘 역시 거의 밝혀지지 않았다. 최근 연구에 따르면, BAP1은 UV 조사 후 PARP1와 상호작용하고, UV로 인한 DNA 손상의 복구를 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 본 연구에서는 UV에 의해 발생한 DNA 손상을 복구하고 암세포의 증식을 억제하는 BAP1의 활성에 있어 PARP1이 매개하는 폴리 ADP-리보실화(이하 PARylation)의 역할을 조사하였다. 먼저, PARP1이 BAP1을 PARylation하고, 이러한 PARP1에 의한 BAP1의 PARylation이 UV에 반응하여 증가한다는 것을 입증하였다. UV에 의한 BAP1 PARylation의 증가는 일시적이며 UV 세기에 의존적이다. In vitro에서 BAP1과 PARP1을 반응시킨 후 그 반응물로 LC-MS/MS를 수행함으로써 PARP1이 BAP1의 여러 부위를 PARylation한다는 것이 밝혀졌는데, 이러한 PARylation 부위들 중 여러 부위가 다양한 암에서 돌연변이 되어 있으며, 특히 Glu-30과 Glu31이 신장세포암 및 흑색종에서 높은 빈도로 돌연변이 되어 있다는 것을 발견하였다. 흥미롭게도, 두 아미노산 잔기가 PARylation 되지 못하는 아미노산인 Ala로 각각 돌연변이 될 경우, 유비퀴틴이 매개하는 프로테아좀 분해에 의해 BAP1의 안정성이 크게 감소되는데, 이는 Glu-30과 Glu31에서 PARylation과 ubiquitinaion 간의 어떠한 상호작용을 통해 BAP1의 안정성을 촉진할 수 있음을 시사한다. 뿐만 아니라, Glu-31은 UV에 의해 발생한 DNA 손상을 복구하는 BAP1의 활성에도 필수적이다. 더욱 주목할 만한 것은, BAP1이 없거나 돌연변이 BAP1을 발현하는 신장세포암인 UMRC-6와 KMRC-20 세포주에서 이들 세포의 생존을 억제하는 BAP1의 종양 억제 활성이 E31A 돌연변이에서는 크게 손상되어 있다는 것이다. 이러한 E31A 돌연변이체의 결함은 야생형 BAP1과 유사한 수준으로 발현되더라도 회복되지 않는다. 이는 Glu-31 잔기가 BAP1의 안정성을 촉진하는 것 외에 PARylation과 관련된 다른 경로를 통해서도 BAP1의 종양 억제 활성에 기여함으로써 암세포 생존력을 감소시킨다는 것을 의미한다. 이러한 결과들은 PARP1이 매개하는 BAP1의 PARylation이 ubiquitination과의 상호작용을 통해 BAP1을 안정화시키고, 또한 BAP1 안정성을 조절하는 것 이외의 메커니즘을 통해 암세포 증식을 억제하는 BAP1의 종양 억제 활성을 촉진할 수 있음을 시사한다.