Development of Metabolically Engineered Microorganisms for the Production of 1,3-Butanediol

Abstract

In this study, two microbial strains, Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum, were metabolically engineered for the production of 1,3-butanediol(1,3-BDO). Considering the high dependence on coenzymes and the importance of alcohol dehydrogenase of the constructed pathway, the oxygen-sensitive bld gene was replaced with the StpduP gene and various native alcohol dehydrogenases were broadly investigated. Three endogenous alcohol dehydrogenases(ybbO, ydfG, yqhD) were selected via flask culture, and modified culture conditions were applied to those strains to enhance the titer of 1,3-BDO. As a result, the highest titer of each strain was achieved by the recombinant E. coli strain B-SABq and the recombinant C. glutamicum strain C60SqAB, 802 mg/L and 995 mg/L. In the case of recombinant E. coli strains, organic acids were produced as the main byproduct. Negative effects such as cell growth inhibition and the relatively low titer were reported by previous studies due to the excessive accumulation of acidic byproducts during cultivation. Therefore, elimination of competing byproduct pathways encoded by ackA, adhE, frdB, pflB, and poxB was performed, and derivatives of single deletion mutants were cultivated under the modified culture condition. Contrary to expected effects, the application of genome editing techniques showed no significant difference in the product titer. Overall, this study focused on the 1,3-BDO production capacity of recombinant microbial strains obtained by introducing the constructed synthetic pathways. Those microbial strains were found out to produce the product effectively when modified culture conditions were applied, however, it was difficult to achieve the expected improvement with single deletion mutants. In other words, additional manipulation of single deletion mutants and optimization of culture conditions might be a key factor for the development of the superior microbial cell factories, targeting the best candidate for the commercial production of 1,3-BDO.;본 연구에서는 미생물을 이용한 1,3-BDO 생산에 목적을 두고, 외래 유전자의 도입과 내재유전자의 과발현을 통해 Escherichia coli와 Corynebacterium glutamicum 균주 내 1,3-BDO 생산을 위한 대사회로를 구축하였다. 선행 연구에서 제안된 대사회로가 조효소에 대한 의존도가 높다는 점과 알코올류의 생물학적 합성을 위해서는 알코올 탈수소 효소의 역할이 중요하다는 점을 고려하여 기존에 사용하던 C. acetobutylicum 유래 bld 유전자를 S. enterica 유래 StpduP 유전자로 대체하였고, 다양한 대장균 유래 알코올 탈수소 효소를 탐색하여 도입하였다. 이후, 플라스크 수준의 배양을 통해 알코올 탈수소 효소 중 세 가지(ybbO, ydfG, yqhD)를 선별하였고, 다양한 온도 조건과 배지 조성 하에 배양 실험을 진행하여 선별된 균주의 1,3-BDO 생산능을 개선하고자 하였다. 그 결과, 제작한 재조합 대장균 균주 중 B-SABq를, 재조합 코리네박테리움 균주 중 C60SqAB를 이용했을 때 가장 많은 양의 1,3-BDO(802 mg/L; 995 mg/L)가 생산됨을 확인하였다. 재조합 대장균 균주의 경우, 배양 시에 유기산류 부산물이 과량으로 축적됨을 확인할 수 있었다. 이는 배양액의 pH 값을 낮추어 성장을 저해할 뿐만 아니라, 구축된 대사회로가 아세틸-CoA를 중간체로 활용하므로 1,3-BDO로의 탄소 플럭스를 감소시키는 요인으로 작용하게 될 가능성이 높다. 이에 따라 주요 경쟁 대사회로에 관여하는 다섯 가지 유전자를 탐색하여 이들을 제거한 딜리션 뮤턴트를 확보하여 해당 균주에 대한 배양 실험을 진행하였다. 예상과는 달리, 유전체 편집 기술을 적용하였을 때에는 유의미한 개선 효과를 확인할 수 없었다. 본 연구를 통해 재조합 플라스미드의 도입을 통해 확보한 균주들이 특정 배양 조건 하에서 생산능이 증가하였으며, 하나의 유전자를 딜리션한 뮤턴트로는 기대한 개선 효과를 얻기 어렵다는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 추후 산업적인 활용이 가능한 대량 생산용 균주를 확보하기 위해서는 배지 조건 최적화와 동시에 제작한 딜리션 균주에 대한 추가적인 조작이 요구되리라 생각된다.