Role of Cysteine Proteases in Triple-Negative Breast Cancer and Liver Fibrosis

Abstract

Triple Negative Breast Cancer (TNBC) is known as the most aggressive subtype of breast cancer due to its prognosis and difficult treatment. The survival rate of TNBC is very low, especially when metastasis has occurred. In TNBC patient, it has been reported that high expression of calpain 2 is negatively correlated with survival. Calpains are one of the calcium-dependently activated cysteine proteases involved in apoptosis, autophagy, and migration-invasion response. Metastasis is the process by which cells detached from primary tumor circulate through blood or lymphatic vessels and form colonies in distant organs. In general, anchorage-dependent cells undergo anoikis, a kind of apoptosis that occurs when detached from the ECM, whereas cancer cells have anoikis resistance then successfully metastasize. For this reason, anoikis is a promising therapeutic strategy for the treatment of metastatic TNBC. In this study, I found that high expression of calpain 2 had lower survival rate in TNBC patients, unlike the case of high expression of calpain 1. In breast cancer cell lines, TNBC cell lines showed high expression of calpain 2 and was confirmed to have anoikis resistance. I aimed to reveal the correlation between calpain 2 and anoikis, it was elucidated that MDAMB- 231-shCAPN2 cells are sensitive to anoikis unlike parental cells. In addition, calpains are upregulated in activity, protein and mRNA level in suspended culture. This is because their transcription factor NF-кB is activated under anchorage-independent environment. MDA-MB-231-shCAPN2 cells decreased nuclear localization and activity of NF-кB by regulating IкB phosphorylation in detachment condition. It suggested that the possibility of reciprocal regulation between NF-кB and calpain 2. Through the results, calpain 2 would be a novel anti-cancer target to overcome anoikis resistance in TNBC. Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is a disease in which fat accumulates in the liver, not caused by excessive alcohol use. The number of NASH patients is increasing due to the recent increase in obesity rates. Treatment of NASH is important because the stage from NASH to cirrhosis is an irreversible liver fibrosis progression. However, there is no drug to treat NASH, so drug development is needed. Recently, it has been reported that the expression of cathepsin S is highly expressed in patients with alcoholic steatohepatitis. Cathepsin S is one of the cysteine proteases and is also known to be involved in the inflammatory response by regulating cytokines. Unlike other members of lysosomal proteases, cathepsin S remains catalytically active not only in acidic condition but also in neutral pH physiological environment, which makes it possible to regulate substrates located in other subcellular location as well as in lysosome. As NASH treatment, cathepsin S can be a prominent therapeutic target. In this study, I screened newly synthesized 184 compounds to discover a novel selective cathepsin S inhibitor. TS-75, structurally optimized via third generation, showed the most potent cathepsin S inhibitory activity in vitro assay. The binding mode of TS-75 with cathepsin S was also evaluated in silico docking study. The cathepsin S inhibitory activity of TS-75 was confirmed in cell-based assay system and TS-75 had anti-fibrotic effect by reducing fibronectin in activated HSC cells. Through the results from in vitro, in silico, and cell-based studies, I discovered a potent cathepsin S inhibitor with novel structure.;삼중음성 유방암은 3가지 주요 수용체가 음성이기 때문에 호르몬 치료나 HER2 표적 치료가 어렵고 가장 예후가 좋지 않은 유방암으로 특히, 전이가 일어나면 삼중음성 유방암 환자의 생존율은 매우 낮다. 칼페인 2는 칼슘 의존적인 시스테인 프로테아제로 발현이 높을 때 삼중음성 유방암 환자의 생존율이 좋지 않음이 보고되었다. 그리고 세포가 세포외 기질에서 떨어지게 되면 아노이키스라는 세포 사멸을 겪는데 암세포는 이에 대한 저항성을 가져 전이가 가능하다. 그래서 아노이키스는 삼중음성 유방암의 억제를 위한 치료 전략으로 제시되고 있다. 본 연구에서 칼페인 2의 발현이 높을 때 삼중음성 유방암 환자들의 생존율이낮음을 확인하였고 칼페인 1의 발현에는 그러한 경향이 나타나지 않았다. 유방암 세포주 중 삼중음성 유방암 세포주에서 칼페인 2의 발현이 높으며 종양구 형성 능력이 높아 전이 가능성을 예측하였다. 전이 형성능이 뛰어나다면 아노이키스에 저항성을 가질 것이라고 생각하였고, 따라서 칼페인 2와 아노이키스의 상관관계를 보고자 하였다. 아노이키스 유도환경에서 칼페인 2 넉다운 세포의 증식 감소와 세포 사멸의 증가가 확인되었다. 또한, 칼페인 1과 2의 발현이 아노이키스 유도 환경에서 모두 증가하였고 그 이유는 둘의 공통적인 전사인자인 NF-κB의 활성화 때문이었다. 하지만 비부착환경에서 칼페인 2 넉다운 세포의 NF-κB 활성의 증가 정도가 다른 세포에 비해 작아 상호 규제의가능성을 확인하였다. 이러한 사실을 바탕으로 칼페인 2를 타겟으로 하여 아노이키스를 유도하므로써 삼중음성 유방암의 전이를 억제할 수 있다. 비알코올성 지방간염은 간세포에 지방이 축적된 질환으로 그 원인이 알코올 섭취가 아닌 경우이다. 간 섬유화 단계에서 비알코올성 지방간염에서 더 진행되어 간 경변에 이르게 되면 비가역 단계이기 때문에 비알코올성 지방간염의 치료가 중요하다. 그래서 비알코올성 지방간염 치료제를 발굴하기 위한 약물 개발이 활발히 진행되고 있다. 카뎁신 S 는 시스테인 프로테아제 중 하나로 산성뿐만 아니라 중성 pH 에서도 활성을 유지하여 리소좀 밖에서도 기능할 수 있다. 최근 카뎁신 S 가 면역 반응에 관여한다는 것이 밝혀지고 있으며 알코올성 지방간염 환자에서 발현이 높음이 보고되었다. 그러므로 비알코올성 지방간염 치료제로 카뎁신 S 억제제를 발굴하고자 하였다. 5세대에 걸친 총 184개의 화합물에서 카뎁신 S 억제 효과를 확인하였고 3세대의 TS-75의 활성이 가장 좋았다. 그리고 TS-75가 카뎁신 S와 결합하는 결합 잔기를 크리스탈 구조로 확인하였다. TS-75와 다른 시스테인 프로테이즈에서 IC50 값을 비교함으로써 카뎁신 S에 선택적인 억제제임을 보았다. HEK293 세포에서 카뎁신 S를 과발현시킨 후 TS-75를 처리하였을 때 카뎁신 S의 활성을 억제하였다. 또한, 활성 간 성상세포에서 TS-75에 의해 간 섬유화 시 축적되던 세포외 기질 단백질이 감소하였다. 이러한 결과를 통해, 새로운 구조를 가진 카뎁신 S의 억제제를 발굴하였고 비알코올성 지방간염 치료제로서 가능성을 확인하였다.