Anti-inflammatory and Antioxidant Mechanism of Urolithin B in Activated Microglia

Abstract

Urolithin B is one of the gut microbial metabolites of ellagitannins, which have a number of biological activities such as anti-cancer, anti-microbial, anti-inflammatory, antioxidant, and neuroprotective effects. Urolithin B showed anti-cancer activities against various cancer cells, prevented muscle atrophy, recovered cardiac function, and decreases amyloid β1-42 fibrillation via penetration into brain. In the present study I examined the anti-inflammatory and antioxidant activities of urolithin B in brain microglia. Urolithin B inhibited the production of nitric oxide (NO) and pro-inflammatory cytokines, while it increased the anti-inflammatory cytokine IL-10 in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 microglial cells and rat primary microglia. In addition, urolithin B inhibited NO, TNF-α and IL-6 production in poly(I:C)- or LTA-stimulated BV2 cells, suggesting that the anti-inflammatory effect of urolithin B is not confined to LPS stimulation. Subsequent RT-PCR and western blot analyses showed that urolithin B regulates the expression of iNOS, TNF-α, IL-1β, COX-2 and IL-10 at mRNA and protein levels in LPS-induced BV2 cells. More detailed mechanistic studies showed that urolithin B suppressed the phosphorylation of JNK, ERK, Akt, and enhanced the phosphorylation of AMPK, which is associated with anti-inflammatory and antioxidant processes. Urolithin B inhibited the DNA binding and transcriptional activities of NF-κB, by reducing the phosphorylation and degradation of IκBα. Urolithin B also showed antioxidant effect by reducing intracellular ROS production and NADPH oxidase subunit expression, and by upregulating the antioxidant hemeoxygenase-1 expression via Nrf2/ARE signaling. Treatment of neuronal cells with conditioned media from urolithin B + LPS-treated BV2 cells ameliorated the cell death induced by LPS-only treated cells. Finally, I demonstrate that urolithin B suppressed microglia activation in LPS-injected mouse brains. Collectively, the data suggest that urolithin B may have therapeutic potential for neuroinflammatory disorders that are associated with microglial activation.;유로리틴 B는 엘라지타닌이 장내 미생물에 의해 대사되어 생성된 폴리페 놀의 일종으로, 선재된 연구를 통하여 항암과 항균, 항염증, 항산화 및 신경 보호와 같은 다양한 생물학적 활성을 갖고 있음이 보고되어 있다. 유로리틴 B는 다양한 암세포에서 항암작용을 하였으며, 근육의 위축을 막고 심장기능을 회복시키며 뇌혈관장벽을 통과해 아밀로이드 베타의 섬유생성을 감소시키는 작용을 한다고 보고된 바 있다. 그러나 신경염증에서 유로리틴 B의 약리적인 활성은 명확히 보고되지 않았다. 본 연구는 뇌의 소교세포에서 유로리틴 B의 항염증 및 항산화 작용을 규 명하고 자세한 분자적 기전을 분석하고자 하였다. 면역활성물질인 LPS로 활 성화된 소교세포주와 일차배양 소교세포에서 유로리틴 B는 일산화질소와 염 증성 사이토카인의 생성을 감소시켰으며, 항염증 작용을 하는 사이토카인인 인터류킨-10의 생성은 증가시켰다. 또한 다른 면역활성물질인 poly(I:C)와 LTA로 유도한 염증에서 유로리틴 B가 일산화질소와 TNF-α 및 IL-6의 발현을 감소시키는 것을 통하여, 유로리틴 B의 항염증 작용이 LPS에만 국한 되어 나타나는 것이 아님을 알 수 있었다. RT-PCR과 웨스턴 블랏팅을 통하 여 유로리틴 B가 iNOS와 TNF-α, IL-1β, COX-2 및 IL-10의 mRNA와 단백질의 발현을 조절하는 것을 확인하였다. 상세한 기전 연구를 통하여 유로리틴 B가 JNK와 ERK 및 Akt의 인산 화를 저해하며, 항염증과 항산화 작용에 관여하는 AMPK의 인산화를 증가시키는 것을 확인하였다. 나아가 유로리틴 B는 염증과 관련한 유전자 발현에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성을 감소시켰으며, IκBα의 인산화 와 분해 또한 감소시켰다. 다음으로 유로리틴 B의 항산화 작용에 관여하는 분자적 기전을 분석하는 실험을 수행하였다. 유로리틴 B는 LPS에 의한 세포내의 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하였으며, 이에 관여하는 NADPH 산화효소 서브유닛의 발현을 감소시켰다. 그리고 Nrf2/ARE 신호 전달 경로를 활성화하여 항산화효소인 HO-1의 발현을 증가시켰다. 그리고 LPS를 처리한 소교세포주에서 얻은 세포 배양액을 뉴런세포에 처리하였을 때, 유로리틴 B는 뉴런세포의 사멸을 완화시켰다. 마지막으로 이러한 유로리틴 B의 효능을 LPS를 복강 내 주사하여 전신 염증을 유발한 쥐의 뇌에서 확인하였다. LPS 주사에 의해 뇌의 피질과 해마, 흑질 부분에서 소교세포가 활성화되는 것을 Iba1 염색을 통해 관찰하였으며, 유로리틴 B를 처리한 그룹에서는 이 세 부분 모두에서 활성화된 소교세포의 수가 감소됨을 확인하였다. 결론적으로 유로리틴 B는 활성화된 소교세포에서 항염증 및 항산화작용 을 나타냄을 실험을 통하여 증명하였다. 따라서, 본 연구는 유로리틴 B가 산화 스트레스 및 소교세포의 활성화를 동반하는 퇴행성 뇌질환의 치료제로 응용될 수 있는 가능성을 제시한다.