Factors associated with the preservation of liver function in renal failure rat model

Abstract

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is characterized by the accumulation of lipids in hepatocytes without a drinking history, and has a high prevalence in the western world. However, recently its prevalence has increased in Asian countries including Korea, showing the prevalence of as much as 50%. If NAFLD persists, it progresses to non-alcoholic steatohepatitis, which progress towards liver fibrosis to liver cirrhosis and liver failure, with some patients developing hepatocellular carcinoma. Chronic kidney disease (CKD) is sometimes accompanied by mild liver disease conditions such as NAFLD, and in patients with cirrhosis and liver failure, kidney function deterioration such as hepatic nephrotic syndrome is more common. There are reports that the mortality rate increases with the deterioration of renal function in the case of liver disease accompanied by CKD. Metabolic syndromes such as obesity and type 2 diabetes are known to be important risk factors for NAFLD, and they are also risk factors for CKD. It is also known that the inflammatory response plays an important role in the progression of liver and kidney diseases. Therefore, it can be hypothesized that liver failure is common in CKD. However, in reality, there are no reports of decreased liver function in renal failure, and it could be hypothesized that there are unknown mechanisms in which liver function is preserved in renal failure. FXR, Nrf2, and HIF-1a are factors known to be related to the process of liver cirrhosis and renal fibrosis, and are known to directly or indirectly regulate NF-kB. The purpose of this study was to observe the changes in the expression of factors related to the protective mechanism of the liver in renal failure, and to elucidate its regulatory mechanisms. The CKD models were constructed using 5/6 kidney resection method using 250g-350g Sprague–Dawley rats, and sham surgery was performed for the control group. Four weeks after surgery, liver tissue was removed from each group, and the expression differences of FXR, Nrf2, and HIF-1a, which are considered factors related to liver protective function, were compared in the liver tissues of the control group and the CKD group. In addition, pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), a substance that inhibits NF-kB, was administered to the CKD model to create a CKD+PDTC model. The liver was excised 4 weeks after surgery to observe changes in FXR, Nrf2, and HIF-1a expression. H&E staining and Masson's trichrome staining were used to observe histological changes, and immunofluorescence, immunohistochemistry, and fluorescence-activated cell sorting analysis (FACS) were performed to identify the expression changes of the factors mentioned above. The results of H&E staining and Masson’s trichrome staining confirmed that there was no difference in the degree of fatty liver between the control group and the CKD group. However, it was observed that in the CKD group, the number of Kupffer cells decreased and the deposition of collagen fibers increased. Through immunofluorescence, FXR expression was found to be increased in the CKD group and decreased in the CKD+PDTC group when compared to the control group. There was no difference in the expression of Nrf2 and HIF-1a between the control group and the CKD group, and the CKD+PDTC group also showed no difference from the control group. In immunohistochemistry, the expression of FXR and Nrf2 was increased in the CKD group. For the FACS analysis, the CKD group showed an increased expression of FXR, decreased expression of Nrf2, and no significant difference with the expression of HIF-1a when compared with the control group. On the other hand, in the CKD+PDTC group, the expression of FXR decreased compared to the control group, and the expression of Nrf2 and HIF-1a also decreased. In conclusion, one of the mechanisms by which liver function is preserved in CKD could be explained with the increasing expression of FXR in liver tissue. However, collagen deposition also increased in the CKD model, which implicates an opposite result, suggesting that there may be several complementary mechanisms related to the preservation of liver function in renal failure, and that further studies are needed to elucidate additional mechanisms and factors.;비알콜성지방간(NAFLD)는 음주력 없이 간세포내에 지질이 5%이상 쌓이는 특징을 가지며 서구권에서 유병률이 높았으나 최근에는 우리나라를 포함한 아시아 국가에서도 빈도가 증가하여 많게는 50%에 가까운 유병률을 보이게 되었다. NAFLD가 지속되면 비알콜성지방간염으로 진행하게 되고 이는 간섬유화를 거쳐 간경화 및 간부전으로 진행하며 이 중 일부에서는 간세포암이 발병하기도 한다. NAFLD와 같이 경증의 간질환 상태에서도 만성신질환(CKD)이 동반되는 경우가 있으며 간경화 및 간부전 환자들에서는 간신증후군 등 신장 기능이 저하가 동반되는 경우가 더 흔하다. 간질환에 CKD이 동반된 경우 신장기능의 악화에 따라 사망률이 높아진다는 보고들이 있고 따라서 간기능 악화에 따른 신장기능의 악화와 관련된 기전에 대해서는 수많은 연구가 시행되어 기전이 밝혀져 있다. 비만 및 제2형당뇨병과 같은 대사증후군은 NAFLD의 중요한 위험인자로 알려져 있으며 이들은 CKD의 위험인자이기도 하다. 또한 두 질환의 진행 과정에 염증반응이 중요한 역할을 한다는 것도 이미 알려져 있다. 그러므로 CKD에서도 간기능저하가 동반되는 경우가 흔할 것이라는 가설을 세울 수 있다. 하지만 실제로 신부전에서는 간기능이 저하되었다는 보고들은 거의 없으며 신부전에서는 간기능이 보존되는 밝혀지지 않은 기전들이 있을 것이라는 가설을 세울 수 있었다. FXR, Nrf2, HIF-1a는 간경화와 신섬유화가 진행되는 과정과 관련이 있다고 알려진 인자들로써 NF-kB를 직접 또는 간접적으로 조절한다고 알려져 있다. 따라서 이 인자들을 대상으로 하여 신부전에서 간의 보호기전과 관련된 인자들의 발현이 어떤 변화를 보이는지 관찰하고 그 조절 기전을 밝히고자 하였다. 250g-350g의 Sprague–Dawley rat을 이용하여 5/6 신장 절제 방법을 통한 CKD모델을 제작하였고 control군은 sham 수술을 시행하여 제작하였다. 이후 수술 후 4주뒤 각각의 군에서 간조직을 적출하여 control 군과 CKD 군의 간조직에서 간 보호기능과 관련된 인자들로 생각되는 FXR, Nrf2, HIF-1a의 발현 차이를 비교하였다. 또한 CKD 모델에 NF-kB를 억제하는 물질인 pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)를 투여하여 CKD+PDTC모델을 만들었고 수술 후 4주뒤 간을 적출하여 FXR, Nrf2, HIF-1a발현의 변화를 관찰하였다. H&E 염색과 Masson's trichrome 염색을 통해 조직학적 변화를 관찰하였고 면역형광, 면역조직화학, 형광 활성화 세포분류 분석(FACS)을 시행하여 위의 3가지 인자의 발현 변화를 확인하였다. H&E 염색 및 Masson’s trichrome 염색을 방법을 통해 확인한 결과 control군과 CKD군 사이에 지방간 정도에는 차이가 없었으나 CKD군의 경우 Kupffer cell의 수가 감소하였고 collagen fiber의 침착은 증가하였다. 면역형광 결과 FXR은 control군에 비해 CKD군에서 발현이 증가하였고 CKD+PDTC군에서는 발현이 감소하였다. Nrf2와 HIF-1a는 control군과 CKD군 사이에 발현의 차이가 없었고 CKD+PDTC군에서도 control군과 차이를 보이지 않았다. 면역조직화학결과 CKD군에서 FXR과 Nrf2의 발현이 증가한 양상을 보였다. FACS analysis를 통해 각 인자들의 발현정도를 확인한 결과 control군에 비해 CKD군에서 FXR은 발현이 증가하였고, Nrf2는 발현이 감소하였으며 HIF-1a의 발현은 control군과 비교하여 큰 차이가 없었다. 반면 CKD+PDTC군에서는 control군에 비해 FXR의 발현은 감소, Nrf2와 HIF-1a도 발현이 감소하였다. 결론적으로 CKD에서 간기능이 보존되는 기전 중 하나를 FXR의 발현이 증가로 생각 해 볼 수 있었다. 다만 collagen 침착은 CKD모델에서 증가하는 반대의 결과를 보였는데 이것은 신부전에서 간기능의 보존과 관련된 여러가지 상호 보완적인 기전이 있을 수 있음을 시사하며 추후 추가적인 기전과 인자들을 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다.