Changes of Esophageal Mucosal Integrity and Mucosa-associated Microbiota in Gastroesophageal Reflux Disease

Abstract

Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a condition in which gastric contents regurgitate into the esophagus or beyond, resulting in either troublesome symptoms or complications. It shows various phenotypes with esophageal mucosal break or complications detected by esophagogastroduodenoscopy (EGD) or physiological tests such as 24-hour pH-impedance study. The representative histologic findings of GERD are known as dilated intercellular space (DIS), basal cell hyperplasia (BCH), and papillary elongation (PE). These histopathologic findings are adjunctive and inconclusive to diagnose GERD, but can be reliable tool for detecting microscopic inflammatory and regenerative lesions in patients with GERD. The esophageal epithelium has tissue resistance as barrier mechanism to defense against acid injury caused by gastric refluxate. The tissue resistance is maintained with mucosal barrier by intercellular protein complexes such as tight junction, desmosome and adherens junction. Recently tight junction and adherens junction had no effect on esophageal electrical resistance. The study on the role of desmosome in GERD is limited. In inflammatory bowel disease, it has been reported that cell-cell adhesion decreases due to inflammation of the intestinal mucosa, and results increase in mucosal permeability. Also, disruption of the intestinal barrier is related to microbiota dysbiosis, and this breakdown of intestinal homeostasis is known as the pathogenesis that causes inflammatory bowel disease. We hypothesize that damage of the distal esophageal mucosa due to gastric acid reflux can be related to barrier function, and it may be related with microbial dysbiosis at distal esophagus in GERD. Therefore, the aim of this study was to investigate the changes of intercellular proteins related with mucosal integrity and the changes of esophageal mucosal microbiota in GERD, and its association. Study subjects who underwent EGD were enrolled prospectively from June 2017 to May 2019. GERD was classified as NERD, ERD and BE. The controls are subjects who underwent EGD for anemia and medical check-up without gastrointestinal symptoms. Two esophageal tissues were obtained from the distal esophagus 2 cm above the gastroesophageal junction for all subjects with pinch biopsy via forceps during EGD. To evaluate mucosal integrity of distal esophagus, GERD-specific histologic findings including dilated intercellular space (DIS), eosinophil and neutrophil infiltration, basal cell hyperplasia (BCH) and papillary elongation (PE) with Hematoxylin-Eosin (H-E) staining and the expression of intercellular proteins including plakoglobin, desmoglein-1, desmoglein-3 (Dsg3), ADAM10 with immunohistochemical (IHC) staining were evaluated. The esophageal mucosal microbiota was analyzed using tissue obtained by the endoscopic mucosal biopsy. DNA extraction from the esophageal mucosal samples was performed according to the manufacturer’s protocol. The extracted DNA was amplified with primer targeting from V3 to V4 regions of the 16S rRNA gene. The amplified mixed amplicons were purified, pooled, trimmed, denoised to analyze microbiota. The change of composition, alpha diversity (richness) with identified operational taxonomic units, Chao1 index, Shannon index and beta diversity (between-subject diversity) with principal component analysis and the permutational multivariate analysis of variance based on UniFrac distances test were analyzed. The difference of taxa between groups was identified using the linear discriminant analysis effect size (LEfSe). The 109 patients were enrolled initially. Of the 109 patients, 106 subjects were finally enrolled, excluding 3 histologically diagnosed eosinophilic esophagitis. Of these, 31 subjects were excluded additively due to tangentially cut esophageal biopsy samples were obtained, and BCH could not be assessed. Finally, seventy-five subjects were eligible for analysis. GERD-specific histologic findings such as DIS, BCH and PE were significantly increased in ERD, compared to NERD, BE and controls, however, there was no significant differences among NERD, BE and controls. In IHC staining of mucosal barrier proteins, the loss of Dsg3 was significantly observed in the basal layer of ERD group, compared to controls, and it was correlated with the severity of reflux esophagitis. Also, the loss of Dsg3 was significantly correlated with DIS, eosinophil infiltration, BCH and PE. The patient-specific profile of the bacterial community was analyzed. The most identified phylum in the esophageal mucosal microbiota within controls and GERD groups were Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes and Actinobacteria, which accounted for 95.8% of controls of the total bacterial 16S rRNA gene sequences. Fusobacteria was only observed in NERD, ERD and BE. There were no significant differences in the overall composition of the esophageal mucosal microbiota of patients between each phenotype of GERD and controls. Also, there was no difference of the composition change of the esophageal microbiota according to GERD-specific histologic findings. Compared to controls, the species richness (alpha diversity) was not different among ERD, NERD and BE, but richness was significantly reduced in GERD patients with the presence DIS (Shannon, p = 0.013) and BCH (Chao1, p = 0.025). However, the microbiota structure (beta diversity) was not different between three GERD phenotypes (ERD, NERD and BE) and controls. Also, beta diversity was not different according to the presence of GERD-specific histological findings. In the analysis of taxonomic difference with LEfSe, the most dominant taxon was Roseburia in NERD, Actinobacteria in ERD and BE, compared to controls, respectively. In ERD, Aggregatibacter was dominant compared to NERD. In controls compared with ERD and BE, Verrucomicrobia was found dominantly. It was also identified dominantly in NERD compared with ERD. According to GERD-specific histologic findings, Actinobacteria in the presence of DIS, Lactobacillaceae in the presence of BCH, Peptococcaceae in the presence of PE and Streptomyces in loss of Dsg3 was found dominantly compared to controls. In conclusion, GERD-specific histologic findings including DIS and BCH are associated with the damage of desmosomal proteins and it was related with reduced richness of esophageal mucosal microbiota and taxonomic differences. However, the dysbiosis of esophageal microbiota is not significantly associated with esophageal desmosomal loss. Further studies are needed on whether it may involve with mechanisms other than esophageal barrier dysfunction in the pathogenesis of GERD, or whether the microbiota in the esophageal lumen is a secondary change due to changes in the distal esophageal environment due to gastric refluxate.;위식도 역류질환(gastroesophageal reflux disease, GERD)에서 만성적인 위산, 펩신 혹은 담즙산 등은 식도 점막 투과도에 변화를 주어 식도 점막의 조직학적 변화와 만성 염증을 유발할 수 있고, 하부 식도 점막 연관 세균총은 투과도가 변화된 식도에 영향을 주어 GERD의 병태생리에 영향을 줄 수 있다. 본 연구는 GERD 환자에서 특징적인 식도의 조직학적 변화와 점막 투과도의 변화를 관찰하고, 하부 식도 점막 연관 세균총과의 연관성을 알아보고자 하였다. 이대목동병원에서 2017년 6월부터 2019년 5월까지 상부위장관내시경 검사를 받은 18세 이상 성인으로 미란성 역류질환(erosive reflux disease, 이하 ERD), 비미란성 역류질환(nonerosive reflux disease, 이하 NERD), 바렛 식도 및 대조군을 대상으로 진행되었다. 식도 조직은 상부위장관내시경 시행 중 위식도접합부 상방 2 cm의 위치에서 겸자를 사용하여 두 조각을 획득하여, 하나는 조직학적 확인을 위해 10% 포르말린 용액에 고정하였고, 다른 한 조각은 점막 연관 세균총 분석을 위하여 액화 질소에 보관하였다. GERD 특이적 조직학적 소견을 확인하기 위하여 헤마톡실린-에오신 (Hematoxylin-Eosin, H-E) 염색 및 식도 점막 투과도를 확인하기 위하여 점막 장벽 중 부착반점 단백인 plakoglobin (Pg), desmoglein-1 (Dsg1), desmoglein-3 (Dsg3)과 부착연접 단백인 a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10 (ADAM10)에 대해 면역조직화학염색을 시행하고, 두 명의 병리 의사가 반정량적인 방법으로 조직 소견을 등급화 하였다. 식도 조직으로부터 DNA를 분리하여 16S rRNA 유전자 V3-V4 부위의 프라이머를 이용하여 증폭 후 Illumina MiSeq 방법으로 염기 서열을 분석하여 식도 점막 연관 세균총 분석을 진행하였다. 각 군별로 식도 점막 연관 세균총의 조성 변화, 개체 내에서의 다양성 변화, 개체 간의 다양성 변화 및 군 별 우세한 균종을 확인하였다. ERD에서 대조군과 비교하였을 때, H-E 염색에서 세포사이공간의 확장 (dilated intercellular space, DIS), 식도 점막 기저층의 과증식(basal cell hyperplasia, BCH), 고유층 유두 신장 (papillary elongation, PE), 호산구 침윤과 같은 GERD 특이적 조직학적 소견이 유의하게 증가하였다. 점막장벽 단백에 대한 면역조직화학염색에서 식도 점막 기저층에서 Dsg3이 소실되는 것을 확인하였고, 이는 역류성 식도염의 중증도가 심해질수록 더 많이 소실되었으며 통계적으로 유의한 상관성을 보였다. 식도 점막 세균총의 조성 변화를 GERD에 따라서 문(phylum) 수준에서 분석하였을 때, NERD, ERD, BE 모두에서 Proteobacteria와 Firmicutes가 가장 많이 관찰되었다. NERD와 ERD에서 대조군과 비교하였을 때 Proteobacteria와 Firmicutes의 비율은 감소하고 Bacteroidetes와 Actinobacteria는 증가하였으나 통계적 차이는 관찰되지 않았다. Fusobacteria는 대조군에서는 관찰되지 않았고, NERD, ERD, BE에서만 관찰되었다. 속(genus) 수준에서 분석하였을 때, NERD와 ERD에서 대조군과 비교하여 Ralstonia, Streptococcus와 Haemophilus가 감소하였고, 반면 BE에서는 Ralstonia, Haemophilus는 감소하고 Streptococcus는 증가하였지만 통계적 차이는 없었다. GERD 특이적 조직학적 소견에 따른 식도 점막 연관 세균총의 조성 변화를 문 수준에서 분석하였을 때, DIS, BCH, PE가 관찰되거나 Dsg3가 소실되었을 때 모두에서 Proteobacteria와 Firmicutes가 가장 많이 관찰되었고, 속 수준에서는 DIS나 BCH가 관찰되거나 Dsg3가 소실되었을 때 Ralstonia와 Haemophilus가 감소하였지만 통계적 차이를 보이지는 않았다. GERD 하위 질병군 내에서 식도 점막 연관 세균총의 다양성의 차이가 관찰되지 않았고, ERD, NERD, BE 및 대조군 간의 다양성 변화도 관찰되지 않았다. GERD 특이적 조직학적 소견 중 DIS, BCH가 관찰될 때 GERD 군 내의 식도 점막 연관 세균총의 다양성은 감소하였으나 대조군에 비하여 ERD, NERD 및 BE 군간 다양성 변화는 관찰되지 않았다. GERD 하위 질병군에 따른 식도 점막 연관 세균총의 분류학적 차이를 확인하기 위해 linear discriminant analysis size effect 방법을 이용하여 분석하였다. 대조군과 비교하여 NERD 군에서 Roseburia 속 균주, ERD와 BE 군에서 Actinobacteria 문 균주가 가장 우세하게 관찰되었다. ERD를 NERD와 비교하였을 때 Aggregatibacter 속 균주가 가장 우세하였다. 대조군에서는 ERD, BE와 각각 비교하였을 때 Verrucomicrobia 문 균주가 가장 우세하였다. GERD 특이적 조직학적 소견에 따라 분석하였을 때 DIS가 있는 군에서는 Actinobacteria 문 균주, BCH가 있는 군에서는 Lactobacillaceae 과 균주, PE가 있는 군에서는 Peptococcaceae 과 균주, Dsg3 소실이 관찰된 군에서는 Streptomyces 속 균주가 가장 우세하게 관찰되었다. 결론적으로, GERD 환자에서 DIS, BCH, 호산구 침윤과 PE을 포함한 GERD 특이적 조직학적 소견은 부착반점 단백 소실의 발현과 높은 상관성을 보였고, 식도 점막 연관 세균총의 다양성 감소와도 연관되어 있었다. 그러나 식도 점막세균총의 변화와 식도 점막 투과도 단백의 발현은 유의한 상관성이 없었다. 추후 하부 식도 점막 연관 세균총의 변화가 식도 점막 투과도 이외의 다른 기전으로 GERD에 직접적인 역할을 하는지 또는 위산 역류에 의한 하부 식도 환경의 변화에 의한 이차적인 변화 인지에 대하여 추가적인 연구가 필요하다.