Modulation of BAP1 Activity by a Small Compound Inhibitor and PARP1-Mediated Poly(ADP-ribosyl)ation

Abstract

BRCA1-associated protein-1 (BAP1) is a nuclear deubiquitinating enzyme that contains the ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH) domain and involved in multiple cellular processes, including transcription, DNA repair and replication. BAP1 functions as a tumor suppressor in various cancers, including malignant pleural mesothelioma, uveal melanoma and renal cell carcinoma. However, recent studies showed that BAP1 acts oncogenically in certain types of cancers, such as breast, prostate and colon cancers. Nonetheless, the mechanisms that regulate the activity of BAP1 is unknown. Whether drug-like small molecules can control the BAP1 activity has not been studied. In this thesis, I pursued the investigations to address these important issues. First, I characterized a recently developed small-compound inhibitor that targets BAP1 (BAP1i). Using a purified in vitro system, I verified that BAP1i effectively inhibits the deubiquitinating activity of BAP1 towards an artificial AMC-Ub substrate and the physiological substrate of monoubiquitinated histone H2A (H2A-Ub) assembled into a nucleosome. Then, I found that BAP1i has strong cytotoxic activity with <10 M of half-maximal effective concentrations on several human colon cancer cell lines, which require BAP1 for their survival. My data suggest that BAP1i exerts its cytotoxic activity by inducing DNA replication defects and apoptosis. BAP1i exhibited a higher cytotoxic activity on BAP1-proficient cancer cells than BAP1-null cancer cells, indicating that BAP1i targets BAP1 specifically. Next, I investigated the effects of poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation) on BAP1 activity based on the previous observations that PARP1 interacts with and PARylates BAP1 in response to DNA damage. Using in vitro PARylation-coupled deubiquitination assay, I found that PARylation increases the deubiquitinating activity of BAP1 towards AMC-Ub substrate. In contrast, however, PARylation abrogated the deubiquitinating activity of BAP1 on the H2A-Ub nucleosome substrate. Interestingly, PARylation inhibited BAP1 binding to the DEUBAD domain of ASXL1, which is required for BAP1 binding to nucleosomes, suggesting that PARylation inhibits the deubiquitinating activity of BAP1 on H2A-Ub nucleosome substrate by blocking BAP1 binding to nucleosomes. Finally, I observed that treatment of 293T cells with PARP inhibitor decreased the BAP1 activity, indicating that PARylation promotes BAP1 activity within the cells. In conclusion, I demonstrated that a novel BAP1 inhibitor inhibits the enzymatic activity of BAP1 in vitro and exhibits a strong cytotoxic activity on human colon cancer cells via induction of replication defect and apoptosis. In addition, I found that PARP1 promotes the deubiquitinating activity of BAP1 in vitro via both direct protein-protein interaction and PARylation and provided some evidence that this regulation occurs in vivo. These results show that the enzymatic activity of BAP1 is modulated by a physiological post-translational modification as well as a specific synthetic inhibitor. ;저분자 화합물 억제제와 PARP1에 의한 PARylation의 BAP1 활성 조절 BAP1은 유비퀴틴 C-terminal hydrolase (UCH) 도메인을 함유하고 있으며 전사, DNA 수리, 복제를 포함한 여러 세포 과정에 관여하는 탈유비퀴틴 효소이다. BAP1은 악성 흉막중피종, 흉막흑색종, 신장세포암을 포함한 다양한 암에서 종양 억제제 역할을 한다고 알려져 있지만 최근의 연구에서는 BAP1이 유방암, 전립선암, 대장암과 같은 특정 종류의 암에서는 종양 촉진 인자로 작용한다는 것을 보여주었다. 이렇듯 BAP1의 중요한 기능들이 밝혀지고 있음에도 불구하고 BAP1의 활동을 억제하는 메커니즘은 알려져 있지 않다. 특히, 약물과 유사한 저분자 화합물들이 BAP1 활성을 조절할 수 있을지는 아직 연구되지 않았다. 본 연구에서는, 최근에 개발된 저분자 화합물 억제제 (BAP1i)가 BAP1의 활성에 관여하는지 조사하였다. 먼저, in vitro 실험을 통해 BAP1i가 인공 AMC-Ub 기질과 생리학적 기질인 H2A-Ub 뉴클레오솜에 대한 BAP1의 탈유비퀴틴 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인했다. 그 다음 생존을 위해 BAP1이 필요한, 다양한 인간 대장암 세포 라인에 BAP1i를 처리한 후 DNA 복제 결함과 세포사멸이 증가하는 것을 확인했고 이것은 BAP1i가 강한 세포독성 활동을 유발한다는 것을 나타낸다. 특히, BAP1i는 BAP1-null 암세포보다 BAP1-proficient 암세포에서 더 높은 세포독성 활동을 보였으며, 이는 BAP1i가 특히 BAP1을 목표로 한다는 것을 보여준다. 다음으로 PARP1이 DNA 손상에 대응하여 BAP1과 상호작용하고 PARylates BAP1과 상호작용하는 선행 연구결과를 바탕으로 BAP1 활동에 대한 PARP1 매개 PARylation의 영향을 조사했다. In vitro 실험을 이용하여, PARylation이 AMC-Ub 기질을 향한 BAP1의 탈유비퀴틴 활성은 증가시키지만, 대조적으로 H2A-Ub 뉴클레오솜 기질에 대한 BAP1의 탈유비퀴틴 활성은 증가시키지 못하는 것을 확인했다. 이는 PARylation이 BAP1의 탈유비퀴틴 활성을 높이기는 하지만 BAP1이 뉴클레오솜에 결합하는 데 필요한 ASXL1의 DEUBAD 영역에 대한 BAP1 결합을 억제하여 PARylation이 H2A-Ub 뉴클레오솜에 결합하는 것을 차단함으로써 BAP1의 활성을 억제한다는 것을 시사했다. 마지막으로 PARP1 억제제를 293T 세포에 처리하면 BAP1 활동이 감소하여 PARylation이 세포 내에서 BAP1 활동을 촉진한다는 것을 알 수 있었다. 결론적으로, 본 연구는 새로운 BAP1 억제제가 시험관내 BAP1의 효소 활성을 억제하고 복제결함과 사멸의 유도를 통해 인간 대장암 세포에 강력한 세포독성 활성을 보인다는 것을 증명했다. 또한, 본 연구는 PARP1이 직접 단백질-단백질 상호작용과 PARylation를 통해 시험관내 BAP1의 탈유비퀴틴 활성을 촉진한다는 것을 밝혔고, 이 조절이 체내에서도 발생한다는 것을 증명하였다. 이러한 결과는 BAP1의 활성이 특이적 저분자 억제제 뿐만 아니라 생리학적 단백질 변형에 의해서도 조절될 수 있다는 것을 보여준다.