Binding of TonEBP and ß-catenin to the E-cadherin Promoter is a Key Process of Phenotype Transition of Peritoneal Mesothelial Cells

Abstract

Long-term exposure of the peritoneal membrane to peritoneal dialysate causes inflammation, loss of the peritoneal mesothelial cells (MCs) monolayer, fibrosis, and angiogenesis, which lead to peritoneal dysfunction. The epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of MCs is considered as an early mechanism of peritoneal fibrosis. Tonicity-responsive enhancer binding protein (TonEBP) is a transcriptional factor that enables cellular adaptation to hyperosmotic stress. Recent data demonstrated the potential role of TonEBP in migration and invasion of cancer cells, however the exact mechanisms how TonEBP regulated cell phenotype were not known. β-catenin plays a crucial role in the down-regulation of E-cadherin expression and the induction of EMT, and there is a previous study showing the interaction of TonEBP with β-catenin to repress Wnt signaling. The differential expression and nuclear translocation of TonEBP and β-catenin by osmotic and non-osmotic stimuli and their role in peritoneal EMT were also investigated in peritoneal MCs. EMT was evaluated by morphologic changes and expression of E-cadherin as an epithelial cell marker and α-smooth muscle actin (α-SMA) as a mesenchymal cell marker after stimulation of high glucose (HG, 60 mM), mannitol (60 mM and 120 mM), and TGF-β (1 ng/mL) in human peritoneal mesothelial cells (HPMCs). Nuclear translocation of TonEBP and β-catenin, E-cadherin promoter activity, and interaction of TonEBP and β-catenin were investigated. To clarify the role of TonEBP in EMT, the effect of TonEBP gene silencing by a treatment of siTonEBP on HG- and TGF-β-induced EMT was examined in HPMCs. Peritoneal function and fibrosis was compared in adenoviral vector of TGF-β (ad-TGF-β)-injected TonEBP+/+ and TonEBP+/- mice. Ex-vivo analysis using MCs isolated from dialysate effluent from PD patients was also performed. TonEBP was constitutively expressed in HPMCs. HG, mannitol and TGF-β enhanced the expression and nuclear translocation of TonEBP in HPMCs. HG- and TGF-β-induced EMT in HPMCs was associated with an increased expression and intra-nuclear translocation of β-catenin, which was ameliorated by siTonEBP. However, mannitol did not induce EMT despite an upregulation of TonEBP and β-catenin with their intra-nuclear translocation. We found HG- and TGF-β induced intra-nuclear TonEBP and β-catenin complex formation which bound to the promoter of the E-cadherin gene and decreased E-cadherin promoter activity. However, mannitol induced neither TonEBP/β-catenin complex formation nor decreased E-cadherin promotor activity. In ad-TGF-β-injected peritoneal fibrosis animal model, peritoneal function and morphology were preserved in TonEBP+/- mice, with a reduction in peritoneal thickness and a preservation of ultrafiltration compared to wild-type TonEBP+/+ mice. Ex-vivo analysis using MCs isolated from dialysate effluent from PD patients showed an increased TonEBP expression with an evidence of EMT. This study demonstrates the role of TonEBP as a transcriptional repressor of E-cadherin for the first time. Not the increased expression of TonEBP per se but binding of TonEBP and β-catenin complex to the E-cadherin promoter is a key mechanism by which TonEBP mediates EMT of MCs. These findings suggest that the blocking of TonEBP/β-catenin complex in HPMCs could serve as a novel approach to ameliorate peritoneal damage in PD patients.;복막 투석액에 장기간 노출되면 복막염증과 복막 중피 세포 (peritoneal mesothelial cells)의 단일막 손실이 일어나고, 섬유화 및 혈관 신생을 유발하여 복막의 기능 장애를 일으킬 수 있다. 복막 중피 세포에서 상피-중간엽 세포이행 (Epithelial-to-Mesenchymal Transition, EMT)은 복막 섬유화의 초기 기전으로 알려져 있다. Tonicity-responsive enhancer binding protein (TonEBP)는 고삼투압 스트레스에 반응하는 전사인자로 최근에 암세포의 전이와 침습에 TonEBP가 중요한 작용을 한다는 것은 밝혀졌지만 어떻게 TonEBP가 세포 표현형을 조절하는지 그 메커니즘은 밝혀지지 않았다. β-catenin은 E-cadherin의 negative 조절과 EMT를 유도하는데 중요하게 작용하고, TonEBP와 β-catenin의 상호작용이 Wnt 신호 전달을 억제한다는 보고가 있었다. 본 연구에서는 삼투성/비삼투성 자극에 의한 TonEBP와 β-catenin의 발현과 핵내 이동 변화를 확인하고, 복막의 EMT에 어떠한 역할을 하는지 알고자 하였다. EMT는 HG (60 mM)와 mannitol (60 mM과 120 mM), TGF-β (1 ng/mL)를 처리하여 상피세포 지표인 E-cadherin과 중간엽세포 지표인 α-SMA의 발현으로 평가하였다. EMT 작용 기전으로 TonEBP와 β-catenin의 핵내 이동과 E-cadherin 프로모터 활성도, TonEBP와 β-catenin의 결합을 조사하였다. TonEBP가 EMT에 미치는 영향은 siTonEBP 처리 후 HG와 TGF-β에 의한 EMT의 변화로 조사하였다. 복막의 기능과 섬유화는 TonEBP+/- 마우스에 ad-TGF-β를 복강내주사하여 확인하였다. 또한 복막투석환자에서 분리한 복막 중피 세포에서 TonEBP의 발현을 조사하였다. 복막 중피 세포에서 TonEBP가 발현됨을 확인하였고, HG와 mannitol, TGF-β에 의해 TonEBP 발현이 증가되고 핵내 이동 변화를 보였다. HG와 TGF-β에 의해 EMT가 유도되었고 siTonEBP에 의해 완화 효과를 보였다. 그러나 mannitol에 의해서는 EMT가 보여지지 않았다. 복막 중피 세포에서 HG와 TGF-β에 의해 핵안에서 TonEBP와 β-catenin이 결합하였고, E-cadherin 프로모터 활성이 감소되었다. 그러나 mannitol에 의해서는 TonEBP와 β-catenin이 결합하지 않았고 E-cadherin 프로모터 활성도 차이가 없었다. TonEBP와 β-catenin 결합체가 HG와 TGF-β에 의해 E-cadherin 프로모터에 결합하였고, mannitol에 의해서는 결합하지 않았다. TonEBP+/-마우스에서 ad-TGF-β에 의해 복강벽의 두께가 TonEBP+/+보다 감소하였고, 복막평형검사 결과 TonEBP+/-에서 drain volume과 D/D0 glucose가 TonEBP+/+ 마우스보다 증가하였다. 실제 복막투석환자의 투석액에서 분리한 세포에서 TonEBP의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다. 결론으로, 이번 연구에서는 복막 EMT에서 TonEBP가 E-cadherin의 전사 억제자로서의 역할을 처음으로 입증하였다. 복막 중피 세포에서 EMT는 TonEBP 발현의 증가뿐만 아니라 E-cadherin 프로모터에 TonEBP와 β-catenin의 결합이 핵심 메커니즘임을 증명하였다. 이러한 결과는 TonEBP와 β-catenin의 결합을 막는 것이 복막 투석환자에서 복막 손상을 개선하는 새로운 접근 방식으로 작용할 수 있음을 시사한다.