Effect of cytochalasin B for drug resistance and cancer stemness in breast cancer cells

Abstract

Cytochalasin B modulates cell motility, adherence, secretion, drug efflux, and deformability. Cytochalasin B binds the microfilaments, thereby inhibiting polymerization. Recent studies suggest that cytochalasin B exhibits profound anti-cancer activity in several cancer. However, its efficacy in breast cancer for drug resistance and cancer stemness has not been fully established. To study effect of cytochalasin B, we investigated cell viability and cell cycle after cytochalasin B treatment in adherent and anoikis-resistant breast cancer cells compared to docetaxel. We also examined sphere formation assay, side population assay, ABCG2 gene expression by RT-PCR and immunoblotting to determine ERK, JNK, and AKT expression. Cytochalasin B inhibited cell growth in a dose-dependent manner both of adherent and anoikis-resistant breast cancer cell lines (MDA-MB-231, BT-20, MCF7, SK-BR-3). Cytochalasin B significantly decreased sphere formation, side population, and ABCG2 expression. Cytochalasin B also induced p-ERK downregulation in MDA-MB-231 breast cancer cells. Inhibitor of ERK signaling, U0126 enhanced growth inhibition effect of cytochalasin B in adherent cells. Cytochalasin B induced cell cycle arrest and inhibited the growth of adherent and anoikis-resistant breast cancer cells through downregulation of ERK signaling. In conclusion, these results showed that cytochalasin B exhibited the anti-proliferative effect for drug resistance and cancer stem cells. Cytochalasin B is a potential candidate drug for chemo-resistant breast cancer patients. ;Cytochalasin B(CB)는 액틴의 중합화를 방해하고 세포분열을 억제하는 약물로 세포의 이동, 부착, 약물의 유출을 조절한다. 난소암, 폐암 등에서 CB의 항암 효과에 관한 연구가 보고된 바 있다. 하지만 유방암의 약물 저항성과 암 줄기세포에서의 효과는 완전히 밝혀지지 않았으므로 연구가 필요하다. 파클리탁셀, 도세탁셀 등의 항암제는 유방암 치료에 효과적이지만 약물 저항성을 갖는다는 단점이 있다. 암 줄기세포는 자기 재생, 분화 등의 특징을 가지고 있으며 약물 저항성을 유도하고 암의 재발에 중요한 역할을 한다. 이 연구에서는 유방암의 약물 저항성과 암 줄기세포에서의 CB의 효능에 대해 연구하고자 한다. 먼저 CB가 유방암 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 부착 세포와 anoikis-resistant 세포를 배양해 실험을 진행했다. Anoikis란 세포가 ECM으로부터 떨어져 나가면서 죽는 현상을 말하는데 이에 저항성을 갖고 살아남은 세포를 anoikis-resistant 세포라고 하며 약물 저항성 실험 모델로 주로 쓰인다. CB와 도세탁셀을 유방암 세포주에 처리하고 72시간 후에 cell viability assay와 cell cycle analysis를 진행했다. 다음으로 암 줄기세포의 변화를 확인하기 위해 약물 처리 후 sphere formation assay, side population(SP) assay, RT-PCR을 통한 ABCG2 mRNA 발현을 분석하였다. 마지막으로 CB의 세포 감소 효과에 관련된 신호 전달 경로를 찾고자 약물 처리 후 immunoblotting을 통해 단백질 발현을 확인하였다. CB를 처리했을 때 MDA-MB-231, BT-20, MCF7, SK-BR-3의 유방암 세포주에서 성장이 감소하였으며 G2/M기 cell cycle arrest가 발생하였다. 또한, CB 처리 후 유방암 세포의 sphere 형성 능력이 감소했고 SP 세포의 비율과 ABCG2의 발현이 감소하였다. 반면 도세탁셀을 처리했을 때는 SP 세포의 비율과 ABCG2의 발현이 증가하는 경향을 보였다. 또한 CB를 처리한 세포에서 p-ERK의 발현이 감소하였다. CB와 ERK 신호의 상관관계를 알아보고자 MDA-MB-231 세포에 ERK 억제제인 U0126과 CB의 병용처리를 진행했다. 부착 세포에서는 상승효과가 있었지만 anoikis-resistant 세포에서는 상승효과가 없었다. CB 처리 후 AKT 단백질의 발현이 감소하고 p-AKT 단백질의 발현이 증가하였다. CB와 AKT의 상관관계를 알아보고자 MDA-MB-231 세포에 AKT 억제제인 MK-2206과 병용처리를 진행했다. 부착 세포와 anoikis-resistant 세포에서 모두 상승효과가 없었다. 본 연구는 CB가 유방암 세포에서 약물 저항성을 극복하는 효과가 있으며 암 줄기세포를 감소시키는 새로운 항암제가 될 수 있음을 제시한다. 추가적으로 in vivo 실험이 필요하며 다른 세포주에서도 암 줄기세포를 확인하는 실험이 필요하다.