Development of Ionizable Lipid Nanoparticles (LNPs) for in vivoDelivery of RNA Therapeutics

Abstract

RNA 요법은 유전질환 치료의 유망한 치료법으로 엄청난 관심을 받아왔다. 질병의 표적에 대한 성공적인 유전자 치료를 위해서는 적절한 RNA 전달체계가 필요하다. RNA 치료제를 세포에 안전하게 전달하기 위한 다양한 전달 시스템이 개발되었다. 이들 시스템은 RNA를 세포를 지키는 내·외부 장벽을 극복하고 세포로 안내한다. 양이온성 폴리머와 지질들은 RNA의 세포내 전달에 일반적으로 사용되는 한 예다. 그러나 체외 및 체내 독성 으로 인하여 치료용 안전성에 대한 일부 우려는 여전히 남아 있다. 이러한 독성은 주로 비특이적인 전하 상호작용에 기초하여 발생한다. 따라서 한계를 극복하기 위한 대체 전달 기술이 시급하다. 본 논문에서는 RNA 치료법의 세포내 전달을 촉진하기 위한 다양한 접근법을 제안하였다. 최근 기존 전달 시스템을 대체하는 대안으로 지질 나노입자 (LNP)가 제안되고 있다. 이 시스템은 3차 아민이 함유된 이온화 가능한 지질을 기반으로 하여 주변 pH를 활용할 수 있도록 한다. 산성 조건에서만 양전하를 띠는 이온화 지질은 세포독성을 감소시키는 것으로 나타났다. 제1장에서는 새롭게 합성된 이온화 가능 지질 후보물질로 준비된 LNP를 소개했다. 간, 특히 간세포에 siRNA를 전달하는 능력을 평가하였다. 간세포의 강력한 유전자 조절은 Cre와 CRISPR 시스템을 포함한 mRNA에서 추가로 확인되었다. 제2장에서는 간세포 이외의 다른 세포에 대한 LNP의 표적 전달을 조사하였다. 먼저 간내피세포 (LSEC)에 초점을 맞췄다. 간내피세포는 간경변, 간섬유화 등 만성 간질환과 밀접한 관련이 있어 좋은 타겟이다. 간내피세포의 특정 LNP 전달을 위해 LSEC에 표현된 CD206에 결합하는 만노스 라이간드를 LNP에 수식하였다. 높은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질 함량은 혈액 내 ApoE와의 상호작용을 줄이는 동시에 간내피세포에 대한 흡수를 증가시켰다. PEG-지질 함량이 높은 246C10 LNP에 의해 암 미세 환경 (Cancer microenvironment)으로의 강력한 유입도 확인되었다. 이러한 결과를 종합해 보면, 새로 개발된 LNP는 다른 조직에서 유래한 다양한 질병에 RNA 치료법의 적용 가능성을 넓힐 수 있는 잠재력을 가지고 있다는 것을 보여주었다.;RNA therapy has received tremendous attention as a promising therapeutic to treat genetic diseases.[1, 2] Appropriate RNA delivery systems are required for a successful gene therapy to target diseases. Various delivery systems have developed to deliver RNA therapeutics safely to the cells.[3-7] These systems guide RNA into the cells overcoming the interior and exterior barriers guarding the target cells. Cationic polymers and lipids are one example commonly used for intracellular delivery of RNA. However, some concerns regarding their safety for therapeutic use remain due to their toxicity in in vitro and in vivo. This toxicity is mainly caused based on its non-specific charge interaction. Therefore, there are urgent needs for an alternative delivery technology to overcome the limitation. In this thesis, various approaches have been proposed to facilitate the intracellular delivery of RNA therapeutics.[8-12] Recently, lipid nanoparticles (LNPs) have been suggested as an alternative solution for replacing current delivery systems.[13-15] This system is based on ionizable lipids containing tertiary amine which allows lipid to take advantage of surrounding pH. Ionizable lipids that only become positively charged in acidic conditions have been shown to enhance endosomal release and reduce cytotoxicity. In chapter I, we introduced LNPs, prepared with newly synthesized ionizable lipid candidates. Their ability to deliver siRNA to the liver, especially hepatocytes, was also evaluated. Robust gene regulation in the hepatocytes was further identified with mRNA including Cre and CRISPR system. In chapter II, targeted delivery of LNPs to other than hepatocytes was investigated. First, we focused on liver sinusoidal endothelial cells (LSECs). LSECs are promising drug target because they are closely related with chronic liver diseases such as cirrhosis and liver fibrosis. For LSEC specific delivery of LNPs, we incorporated mannose ligand to LNPs, which binds to the CD206 expressed on LSECs. Higher polyethylene glycol (PEG)-lipid content allowed reduced interaction with ApoE in blood, while increasing the mannose dependent uptake into LSECs. Robust RNA transition rate to cancer microenvironment was also confirmed by 246C10 LNPs with higher PEG-lipid content. Taken together, these results showed our LNPs have the potential to broaden the applicability of RNA therapy to various diseases originated from different tissues.