Part I. Decreased expression of FBXW7 in drug resistant cancer cells inhibits ubiquitin degradation of HSF1 and promotes transcriptional activation of MDR1 Part II. Cathepsin S regulates BRCA1 protein stability and induces radioresistance

Abstract

PART I. Heat Shock Factor 1 (HSF1) acts as a transcriptional regulator of the cellular response to various stress factors such as oxidative stresses or heat shock. HSF1 is increased in drug-resistant cells and is involved in chemoresistance. The relationship between HSF1 and multidrug resistance 1 (MDR1) has not been clearly elucidated, and there are no consistent results between HSF1 and MDR1 in some papers. This study investigated MDR1 regulation by HSF1 in paclitaxel-resistant lung cancer cell (A549-taxolR cells) and doxorubicin-resistant breast cancer cells (T47D-doxR cells and MCF7-doxR cells). The protein level of HSF1 was increased, and the RNA level and protein level of MDR1 were increased in resistant cancer cells compared to parent cells. Knockdown of HSF1 in resistant cell lines reduces mdr1 expression at the mRNA level, suggesting that HSF1 directly interacts with the mdr1 promoter site to play a role as a transcriptional regulator of MDR1. Besides, resistant cells showed altered post-translational modification of HSF1 compared to parent cells. These results indicate that phosphorylation of Ser303/307, which is associated with the protein stability of HSF1 regulated by F-box and WD repeat domain containing 7 (FBXW7), is important for transcriptional activation of mdr1. Overexpression of ERK1/2 in drug-resistant cells reduced the stability of the FBXW7 protein, which eventually inhibited the protein degradation of pHSF1 at Ser303/307. A positive correlation between pHSF1 (Ser303/307) and MDR1 was shown in rat mammary tumors induced by DMBA and human lung cancer tissue. This study provides evidence that the phosphorylation of HSF1 at Ser303 and Ser307 significantly influences the regulation of MDR1. PART II. Breast cancer susceptibility gene 1 (BRCA1) is a tumor suppressor gene and loss-of-function mutations in the BRCA1 gene increase familial breast and ovarian cancer risk. Ionizing Radiation (IR) induced Cathepsin S (CTSS) at mRNA and protein level and increased its protease activity. Moreover, increased CTSS expression is involved in radioresistance. Recently, our research team found that CTSS binds to the BRCT domain of BRCA1 and promoted ubiquitin-mediated protein degradation of BRCA1, which was related to the reduction of BRCA1-mediated DNA repair activity. I thought that the functional recovery of BRCA1 by inhibiting CTSS in TNBC cells would be a good therapeutic strategy for sensitization of cancer cells to exposure IR, because TNBC cells do not have any good treatment targets. I also assumed that CTSS acts differently depending on wild type or mutant type of BRCA1, especially in the BRCT domain. Moreover, I also examined whether phosphorylation of BRCA1 by IR affects the binding activity of CTSS. TNBC cells with wild-type BRCA1 showed a synergistic increase of BRCA1 protein stability by combination of CTSS inhibitors and IR, however, in the case of TNBC cells with BRCT domain mutant, no synergistic induction of BRCA1 was observed. Phosphorylation of BRCA1 at Ser1387 was specific target for CTSS-mediated degradation of BRCA1. From the data, I hypothesized that CTSS interacts with specific phosphorylated BRCA1 at Ser1387, which was induced by IR. Therefore, inhibition of CTSS increased BRCA1 protein stability and induced radiosensitization, especially in TNBC cells with wild type BRCA in BRCT domain. From the results, functional recovery of BRCA1 in TNBC with increased BRCA1 protein stability following CTSS inhibition is a good therapeutic strategy for radiosensitization. However, more detailed mechanism studies are necessary.;PART I. 항암제 내성기전에 대표적으로 관여한다고 알려져 있는 약물수송체인 Multi drug resistance 1(MDR1)은 파클리탁셀 (paclitaxel), 독소루비신 (doxorubicin) 등 다양한 항암제를 기질로써 작용한다. 이러한 MDR1은 산화 스트레스 또는 열 충격과 같은 스트레스 요인에 대한 세포 반응 전사 조절제인 HSF1과 관련이 있다고 알려져 있으나, 일관된 결과가 없어 명확하게 밝혀 지지 않았다. 본 연구에서는 HSF1과 MDR1과의 관계를 파클리탁셀과 독소루비신에 내성을 갖는 암세포 (A549, A549-taxolR; 폐암세포주, T47D, T47D-doxR, MCF7, MCF7-doxR; 유방암세포주)에서 증명하고자 하였다. 우선, 독소루비신에 내성을 갖는 유방암세포에서도 파클리탁셀에 내성을 가짐을 확인하였다. HSF1과 MDR1의 발현은 모세포주에서보다 파클리탁셀 내성세포주에서 증가하였으며, 증가된 HSF1의 발현을 감소시켰을 때 MDR1의 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 이는 HSF1이 MDR1의 전사 조절자로서 작용함을 나타낸다. 또한, 파클리탁셀 내성세포주에서는 HSF1의 번역 후 변형이 모세포주와는 다른 패턴을 나타내는 것을 확인하였다. 파클리탁셀 내성세포주에서 Ser303/307, Ser230은 증가하였으며, Ser326은 감소하였다. 그러므로, 증가된 인산화는 인산화를 억제시키고, 감소된 인산화는 인산화를 모방하여 실험한 결과, Ser303/307이 MDR1의 조절에 관여하는 것을 확인하였다. 기존에 알려진 가설인 HSF1의 Ser303/307이 인산화되면 HSF1의 전사활성화가 억제된다는 것과 다르게 나와 상위조절자인 FBXW7의 발현을 확인하였다. FBXW7은 HSF1의 Ser303/307과 결합하여 HSF1의 단백질 안정성에 관여하는데, 파클리탁셀 내성세포주에서 FBXW7의 발현이 저해되어있어 HSF1이 증가되고, Ser303/307이 또 다른 작용으로 MDR1에 관여하는 것으로 밝혔다. 또한, 내성 세포에서 ERK 1/2의 과발현은 FBXW7의 안정성을 감소시켜 결국 Ser303/307에 의한 HSF1의 단백질 분해를 억제하였다. 쥐에 DMBA를 처리하여 유방종양을 유발하여 얻은 조직과 인간 폐암 조직에서도 Ser303/307과 MDR1 사이에 양의 상관관계가 있었다. 이러한 결과들을 통하여 HSF1의 Ser303/307 인산화가 MDR1의 조절에 중요한 역할을 할 수 있다는 증거를 제시한다. PART II. 삼중음성유방암 (TNBC)은 유방암 중에서 예후가 가장 좋지 않으며, 이 환자를 위한 표적 치료법이 거의 없는 상태로 기존의 수술, 화학요법, 방사선 치료 등이 주로 사용 되어지고 있다. 방사선 치료로 인해 생존율은 크게 향상되었지만, 방사선저항성으로 재발 위험이 높은 상태이다. 이전에 우리 팀에서는 방사선에 의해 카텝신S (Cathepsin S, CTSS)가 증가하며, 방사선저항에 관여하는 것을 밝혔으며, 최근에는 CTSS가 BRCA1의 BRCT 도메인과 상호작용하여 유비퀴틴 매개 단백 분해를 촉진시키며, 그에 따라 BRCA1에 매개된 DNA 복구 활동을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 그러므로, CTSS를 억제하여 BRCA1의 안정성을 높임으로써 BRCA의 기능을 회복하는 것이 삼중음성유방암에서 좋은 치료 전략이 될 수 있을 것이라고 생각하였다. 또한, 이러한 CTSS가 방사선에 의해 인산화되는 BRCA1과 관련이 있을 것이라고 생각하여 CTSS에 매개된 BRCA1의 단백 분해에 관련된 인산화 부위를 찾고자 했다. 실험은 삼중음성유방암 세포 중에서 BRCA1의 야생형을 갖는 세포주와 돌연변이형을 갖는 세포주를 이용하여 진행하였다. 삼중음성유방암세포 중에서 BRCA1의 야생형에서는 CTSS의 상대적으로 낮으면 BRCA1의 발현이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었으나, BRCA1의 돌연변이형에서는 이러한 차이를 확인할 수 없었다. 또한, BRCA1의 야생형에서는 BRCA1의 발현이 증가되면 방사선에 의한 세포사멸도 증가되지만 돌연변이형에서는 증가되지 않았다. 이러한 결과는 BRCA1의 야생형을 가지는 TNBC 세포에서도 CTSS에 의한 BRCA1의 조절이 나타나며, 이는 BRCA1의 BRCT 도메인이 중요한 것을 나타낸다. CTSS 억제제를 처리하였을 때 BRCA1 야생형에서만 BRCA1의 증가와 함께 방사선에 의한 세포사멸 증가를 나타냈다. 또한 방사선에 의해 인산화되는 부위 중 Ser1387의 인산화를 억제하였을 때 BRCA1의 단백질 안정성이 증가되었다. 또한, CTSS에 억제는 BRCA1의 야생형 세포에서 방사선에 민감성을 증가시킨다. 데이터들을 통하여 카텝신S에 의한 작용에 BRCA1의 Ser1387의 인산화가 관련되는 것을 확인하였다. CTSS의 억제는 BRCA1의 단백질 안정성이 감소된 삼중음성유방암에서 BRCA1의 기능적 회복을 위한 좋은 전략임을 제시한다.