Investigating Microbial Ecology on Commercial Alfalfa, Radish, and Rapeseed Sprouts Using 16S rRNA Metagenome Sequencing

Abstract

There have been numerous sprout-related foodborne disease outbreaks and sprouts are known to harbor high populations of bacteria, but little is known regarding their microbial composition. The present study aimed to define the microbiological ecology of sprouts through 16S rRNA metagenome sequencing and culture-dependent methods. Different types (radish, alfalfa, and rapeseed sprout), brands (A, B, and C), and distribution routes (online and offline) of sprouts (n = 70) were collected for microbiome analysis as well as quantitative (total aerobic bacteria and coliforms) and qualitative analysis (E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, and Salmonella Typhimurium). The microbial contamination levels ranged from 7 to 8 log CFU/g (aerobic plate count) and 6 to 7 log CFU/g (coliforms). When microbiome analysis was conducted, Proteobacteria was the dominant bacterial group at the phylum level accounting for 79.0% in alfalfa, 68.5% in rapeseed, and 61.9% in radish sprout, respectively. Enterobacteriaceae was the dominant family in alfalfa (33.9%) and rapeseed sprouts (14.6%) and Moraxellaceae (11.9%) were prevalent on radish sprouts. The majority of the dominant genera were bacteria that commonly exist in environments such as soil or water. Alfalfa sprouts yielded not the highest aerobic plate counts but exhibited the highest relative abundance of Enterobacteriaceae compared to other sprouts. These results could explain the reason why alfalfa sprouts are a leading source for sprout-related foodborne disease outbreaks. Alpha diversity results (Chao1 and Shannon index) suggested that species richness was greater on radish sprouts than other sprout types. Beta-diversity results showed samples were clustered by types indicating dissimilarity in microbial communities. However, there was a limited influence distribution routes on microbial composition. The present study provides a comparative examination on microbial compositional profiles of sprouts. Microbiome analyses should begin to provide profound understanding of the microbial ecology of sprouts leading to potential control measures for ensuring food safety.;새싹채소는 씨앗이 발아한지 일주일 정도 된 어린 채소로 최근 소비자의 신선식품에 대한 수요에 따라 생산 및 소비량이 전세계적으로 증가하는 추세에 있다. 새싹채소의 중온의 다습한 재배환경에 기인하여 7-9 log CFU/g 수준의 총세균수가 보고되고 있으며 E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella 등 식중독 세균에 오염된 새싹채소 섭취로 인한 대형 식중독 사건이 다수 발생하고 있다. 새싹채소에 다수의 미생물이 존재하고 고위해식품으로 간주되는 만큼 새싹채소 내 미생물 생태 규명은 미생물학적 안전성을 이해하기 위해 필수적으로 요구되지만 지금까지는 배양 기반의 분석이 주로 진행되어 새싹채소 내 미생물 균총 정보는 매우 제한적이다. 본 연구에서는 차세대 염기서열 해독기술을 활용하여 배양기술로 검출 불가능한 미생물까지 포함한 총체적인 마이크로바이옴(미생물군유전체) 정보를 얻고자 하였다. 배양법 기반의 미생물 분석(총세균수, 대장균군 정량분석 및 주요 식중독세균 정성분석)과 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 병행하여 새싹채소의 상재균총을 분석하고 구성 정보를 도출하였다. 주요 요인을 새삭채소의 종류(알팔파, 무순, 유채싹), 브랜드(A, B, C), 유통채널(온라인, 오프라인)로 설정하여 총 70건의 시료를 채취함으로써 세 요인의 마이크로바이옴에 대한 영향을 조사하고자 하였다. 새싹채소에는 7–8 log CFU/g의 총세균수, 6-7 log CFU/g의 대장균군이 존재하였으며 E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium은 검출되지 않았다. 마이크로바이옴 분석 결과 문(phylum) 수준에서는 Proteobacteria가, 과(family) 수준에서는 Enterobacteriaceae가 우점종으로 나타났다. 특히 알팔파는 다른 종류의 새싹채소와 비교하여 총세균수는 높지 않았으나 높은 수준의 대장균군 및 Enterobacteriaceae(33.9%)가 나타났다. 대장균군 및 Enterobacteriaceae는 주요 식중독세균을 포함하고 있으며 위생지표세균으로 널리 활용되는 그룹으로, 이러한 결과는 알팔파에 의해 가장 많은 새싹채소 관련 식중독사건이 발생하는 것의 과학적인 근거가 될 수 있다. 새싹채소에 존재하는 미생물 균총의 종 다양성을 나타내는 alpha diversity 지표(Shannon과 Chao1)는 무순에서 가장 높게 나타났다. 시료 간 미생물 군집 구성 차이를 나타내는 beta diversity 결과, 새싹채소의 미생물 군집 구성은 새싹채소의 종류에 따라 다르게 나타났으며, 새싹채소의 유통 경로는 크게 영향을 미치지 않았다. 본 연구는 새싹채소에 존재하는 미생물학적 구성을 규명하기 위하여 배양기반의 미생물 분석 방법과 16S rRNA 염기서열 분석방법을 병행하여 새싹채소 상재균총을 규명하였으며, 이 결과는 추후 새싹채소의 안전성을 확보하기 위한 주요한 기초자료로 사용될 것으로 기대된다.