Structural and functional studies on novel phosphatase Haloacid dehalogenase-like hydrolase domain-containing protein 2 (Hdhd2)

Abstract

Haloacid dehalogenase-like hydrolase domain-containing protein 2 (Hdhd2) is a novel protein found in proteomics analysis of hippocampus from chronic restraint stress (CRS) mouse model. Among 63 proteins that changed after chronic stress, Hdhd2 and ubiquitin-C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) showed drastic post-translational modifications. Structurally, Hdhd2 belong to haloacid dehydrogenase (HAD)-like superfamily having hydrolase and phosphatase activities having Asp residue in active site. However, the biochemical regulations and functions of Hdhd2 are not understood at all. In previous unpublished and this study, Hdhd2 is proved to have phosphatase activity with Asp13 as a catalytic core residue. Since the phosphatase activity of mouse Hdhd2 (mHdhd2) is 3 fold higher than that of human Hdhd2 (hHdhd2) even with 89 % homology, molecular differences were investigated employing mutant studies. Cys4 residue of hHdhd2 is found to play a role for the oxidative regulation of hHdhd2, and mHdhd2 is more sensitive to thermal and urea denaturation than hHdhd2. Cellular functions of Hdhd2 were investigated by examining the signaling pathways in HT22 hippocampal cells silencing or overexpressing Hdhd2 and by identifying the interacting proteins with immunoprecipitation. Hdhd2 is well associated with ribosomal protein complex and regulates the protein synthesis. The results suggest the possibility that Hdhd2 has a neuroprotective function via activating the ribosomal activities.;본 연구에서는 이전 연구에서 확인된 새로운 단백질인 Haloacid dehalogenase-like hydrolase domain-containing protein 2 (Hdhd2)의 분자적 특성 및 세포 내 기능에 대해 연구하였습니다. 이 단백질은 스트레스로 인해 우울증이 유발된 쥐의 해마를 2차원 전기영동 (2D-PAGE) 및 질량분석기 (nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem mass spectrometry)로 분석한 63 개의 단백질 분석 결과 중 ubiquitin-C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1)과 더불어 전사 후 번형 (post-translational modifications)이 상당히 크게 변화한 것을 확인할 수 있었습니다. Hdhd2 단백질은 구조적으로 아스파테이트 잔기를 active site로 갖는 가수분해효소나 탈인산화효소가 속해있는 haloacid dehalogenase (HAD)-like superfamily에 속합니다. Hdhd2는 알려진 바가 거의 없는 단백질로, 앞서의 연구에서 phosphatase 단백질이며, 그 중 13 번에 위치한 아스파테이트 잔기가 핵심 활성부위인 것을 확인한 바 있습니다. 그러나 89%의 일치율을 보이는 Hdhd2 단백질임에도 불구하고 쥐의 단백질과 사람의 단백질 간에 큰 차이를 보였습니다. 쥐의 Hdhd2 단백질이 사람의 Hdhd2 단백질보다 3 배 가량 효소 활성이 좋았으며, 열이나 요소에 의해 보다 더 민감하게, 더 빠르게 변성되어 활성이 감소하였습니다. 두 단백질간에 차이가 나는 아미노산 중 시스테인기나 다른 일부 아미노산을 변형시킨 단백질을 만들어 활성을 조사하였습니다. 그 결과, 사람과 쥐 단백질에 공통적으로 있는 시스테인기인 시스테인 194번, 206번, 244번 이외에 사람 단백질에서만 4번 시스테인이 추가적으로 발견되었습니다. 이 4번 시스테인은 과산화수소에 산화되어 단백질의 이합체를 형성하였으며, 이 시스테인이 없는 단백질은 산화에 덜 민감하게 반응하였습니다. 또한, 세포 내의 기능에 대해 알아보고자 Hdhd2 단백질과 다른 어떤 단백질들이 결합하는지 확인한 결과, 사람의 HEK293 세포에서 과발현된 Hdhd2 단백질에 다수의 리보솜 단백질들과 관련 단백질들이 결합하는 것을 확인하였고, 쥐의 HT22 세포 내의 과발현되지 않은 Hdhd2 또한 다수의 리보솜 단백질들과 결합한다는 것을 다시 한 번 확인하였습니다. HT22 세포에서 Hdhd2를 녹다운하거나 과발현할 때 리보솜 단백질 S6의 양 또한 변화한다는 점에서, 이 Hdhd2 단백질이 리보솜 활성에 작용하여 기능을 나타낼 수 있다고 생각하였습니다.