Effects of Hyper-activated m-Calpain on Acquisition of Doxorubicin Resistance in Breast Cancer Cells

Abstract

Doxorubicin is one of anthracycline anti-cancer drugs and widely used to treat breast cancer. Doxorubicin intercalates into DNA and stabilizes transiently formed topoisomerase II-DNA covalent complex and finally induces DNA strand breaks. Because of DNA damages mediated by DNA strand breaks, doxorubicin belongs to topoisomerase poison drugs. However, treatments of doxorubicin have difficulties because resistance is acquired. Calpains, intracellular cysteine proteases, are activated by Ca2+. Among 15 isoforms in human, µ- and m-calpains are the most commonly described and ubiquitously expressed in many types of cancers. µ- and m-calpains are named after the Ca2+ requirement of μM and mM, respectively, for their full activation in vitro test condition. It has been known that µ- and m-calpains are involved in cell transformation, cell survival, and tumor dissemination. During cell transformation, calpains are activated by oncoproteins and degrade cytoskeletal proteins. Calpains trigger caspase activation leading to apoptosis. Additionally, calpains are involved in formation and disassembly of focal adhesion complexes, which may lead to a prediction of a certain role in cancer metastasis. Even though calpains are well studied in various fields of cancer, the research about the specific roles of each calpain are still needed. In previous study of my laboratory, it was reported that activation of m-calpain, mediated by Ca2+ influx into cells, had an effect on DNA repair pathway. In the point of calpain association on DNA repair, it was hypothesized that m-calpain might be involved in the development of doxorubicin resistance via affecting topoisomerase II. It was observed that treatment of doxorubicin induced intracellular Ca2+ release and increased reactive oxygen species (ROS), leading to abnormal hyper-activation of calpains. Hyper-activated m-calpain, but not µ-calpain, induced increase of truncated cytoplasmic topoisomerase IIα. The doxorubicin-induced attenuation of nuclear topoisomerase IIα caused the decrease in chemotherapeutic activity of doxorubicin. This observation was reproduced with other topoisomerase II-targeting drugs such as etoposide and mitoxantrone. The results obtained from the current study suggest that when drugs stimulate intracellular Ca2+ release, m-calpain becomes hyper-activated to induce truncated cytoplasmic topoisomerase IIα. Overall, the inhibition of m-calpain may be a novel strategy to protect resistance development of topoisomerase II-targeting drugs.;독소루비신은 안트라사이클린계 항암제이다. 독소루비신은 DNA 사이에 끼어들고, 일시적으로 생성된 토포이소머라아제와 DNA 공유결합 복합체를 안정화시켜 DNA 가닥을 절단시킨다. DNA 가닥 절단으로 야기된 DNA 손상 때문에 독소루비신은 토포이소머라아제 독성 억제제로 분류된다. 독소루비신은 유방암치료에 널리 사용되지만 독소루비신 투여 시 형성되는 약물 내성으로 인해 약물 치료에 어려움을 겪고 있다. 세포 내 시스테인계 단백질가수분해효소인 칼페인은 칼슘에 의해 활성화된다. 칼페인은 15개의 이성체를 가지고 있으며, 칼페인 중 µ- 와 m-칼페인이 가장 많이 연구되었고, 많은 종류의 암에서 발현되었다고 보고됐다. µ- 와 m-칼페인 이라 명명된 이유는 생체 외 실험 조건에서 최대의 활성을 가지기 위해 각각 마이크로몰과 밀리몰의 칼슘이 필요했기 때문이다. µ- 와 m-칼페인은 세포형질전환, 세포수명, 종양분화 등에 관여한다고 알려져 있다. 세포형질전환시기 동안 칼페인은 종양 단백질에 의해 활성화되어 세포골격 단백질을 분해한다. 칼페인은 카스파제를 활성화시켜 세포예정사를 유발한다. 또한, 칼페인은 암 전이의 특정 역할을 예측할 수 있는 병소 유착 콤플렉스의 형성과 분해에 관여한다. 칼페인은 다양한 분야에서 연구되었음에도 불구하고 각 이성질체에 따른 역할이 명확하게 규명되지 않았다. 이전 연구에서 칼슘 증가로 인한 m-칼페인의 활성화가 DNA 복구 기전에 영향을 미친다는 것을 밝혔다. DNA 복구에 관련된 칼페인에 초점을 맞추어, m-칼페인이 제 Ⅱ형 토포이소머라아제에 영향을 주면서 독소루비신 내성을 형성에 관여할 것이다라는 가설을 세웠다. 본 연구에서 독소루비신 투여는 세포 내 칼슘 방출과 활성 산소종이 증가를 유도하였고, 이는 비정상적인 칼페인의 활성화를 야기시킴을 확인하였다. 과도하게 활성화된 m-칼페인은 짤린 형태의 세포질 토포이소머라아제의 발현을 증가시켰다. 독소루비신이 유도한 핵에 존재하는 토포이소머라아제의 약화는 독소루비신에 대한 약물 반응성을 떨어뜨렸다. 이 현상은 제 Ⅱ형 토포이소머라아제를 타겟하는 약물인 에토포사이드와 미토잔트론에서도 관찰되었다. 본 연구는 암을 치료하기 위해 사용되는 항암제가 세포 내에 칼슘 방출을 유도하고, m-칼페인을 활성화시켜 짤린 형태의 세포질 토포이소머라아제의 발현을 유도하여 약물에 대한 민감성을 낮춘다는 것을 밝혔다. 따라서 m-칼페인의 억제가 제 Ⅱ형 토포이소머라아제를 타겟하는 약물의 내성 형성을 막는 새로운 전략이 될 수 있음을 제시하였다.