Therapeutic approaches to skeletal diseases in mice

Abstract

Bone remodeling depends on balance of bone-resorbing osteoclasts (OCs) and bone-forming osteoblast (OBs). The imbalance of bone remodeling can result in a variety of bone disorders in humans, such as osteoporosis, periodontal disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, multiple myeloma and metastatic cancers. The OCs are the multinucleated skeletal cells caused bone marrow-derived macrophage precursor cells that are uniquely able to resorb bone and are under the control of immune system. During bone remodeling, osteoclasts remove mineralized bone matrix through adhere to the bone surface tightly and recognize the actin cytoskeleton, occurring in the acidified extracellular microenvironment. PART I: Small molecule-inhibition targeting protein-protein interaction (PPI) is now identified as an appearing and challenging area in drug design. Here, we describe a novel PPI inhibitor, IPS-02001, which is a small molecule antagonist of integrin αvβ3 identified by the interactive methodology of both ProteoChip- and CADD-based PPI assay. IPS-02001 (2, 3-Dichloro-1,4,6,7-tetrahydroxyl-5,8-naphthoquinone) was screened from different compound libraries using an in silico structure-based molecular docking simulation method and a protein chip-based protein-protein interaction assay system. IPS-02001 blocked OC maturation from murine bone marrow-derived macrophages (BMMs), as well as the resorptive function of OCs. Moreover, treatment with IPS-02001 impaired downstream signaling of αvβ3 integrin linked to Pyk2, c-Src, PLCγ2, and Vav3 and disrupted the actin cytoskeleton in matured OCs. Furthermore, IPS-02001 blocked RANKL-induced bone destruction by reducing the number of OCs and protected against ovariectomy (OVX)-induced bone loss in mice. Thus, IPS-02001 may represent a promising new class of anti-resorptive drugs for treatment of bone diseases associated with increased OC function. PART II: TSPAN7, a member of tetraspanin superfamily proteins, is expressed in a specific membrane microdomain, called “TEM”, and is important for osteoclast fusion and function. This study evaluated the efficacy of a novel TSPAN7 antagonist – a recombinant fusion protein that was composed of the soluble TSPAN7 linked to Fc part of human IgG1 (TSPAN7-Fc). TSPAN7-FC blocked OC maturation from murine bone marrow-derived macrophages (BMMs), as well as the resorptive function of OCs. Moreover, TSPAN7-Fc blocked LPS-induced bone destruction by reducing the number of OCs and protected against ovariectomy (OVX)-induced bone loss in mice. Furthermore, TSPAN7-Fc treated mice showed increasing abnormal morphology osteoclasts. These data suggest that TSPAN7-Fc blocked bone loss due to inhibition of normal osteoclast formation. Thus, TSPAN7-Fc may represent a promising new type of anti-resorptive drugs for treatment of bone diseases associated with increased OC formation and function. PART III: Osteoclast-associated receptor (OSCAR) is specifically expressed on preosteoclasts, and signals through the ITAM adaptor protein FcRγ. OSCAR serves as a co-stimulatory receptor for osteoclast differentiation, and was recently found as a collagen receptor. Osteoarthritis (OA) is a universal and debilitating joint disease. There is no effectual medical therapeutic method for the condition because it is relatively unknown about its pathogenesis. We observed an osteoclast-associated receptor (OSCAR) knock-out (Oscar-/-) mouse to investigate the in vivo role of OSCAR in articular cartilage. Oscar-/- mice showed inhibit the articular cartilage degeneration with attendant inhibition of osteoarthritis-targeted catabolic factors expression in OA-induced model. Also, knockout of OSCAR reduce number of osteoclasts exhibits reduced degeneration of subchondral bone plate (SBP) thickness and articular cartilage, which seemed endurable at abnormal mechanical or stress as age. Additionally, the articular cartilage destruction was blocked in OSCAR-Fc treated mice upon both collagenase injection and DMM triggered models. However, OSCAR-Fc affects blocking to proceed further on osteoarthritis not recovery. Furthermore, the expression of active TGF-β1 is decreased in MSCs and immunohistochemistry of the subchondral bone in Oscar-/- mice. Thus, deficiency of OSCAR in subchondral bone seems to initiate the pathological changes of osteoarthritis, and blockade of this process might be a probable therapeutic approach to curing this disease. ;척추동물의 조직 중 하나로 운동과 골격을 유지하며 가장 단단한 뼈는 뼈를 흡수하는 세포인 파골세포 (Osteoclast)와 뼈를 형성하는 세포인 조골세포 (Osteoblast)의 균형으로 항상성을 유지한다. 이러한 균형이 깨졌을 때, 뼈는 항상성이 무너지고 골다공증, 골연화증 (구루병), 퇴행성 관절염 같은 질병을 일으키게 된다. 이러한 질병은 생명에는 크게 문제가 되지 않지만 생활하는 데 있어서 많은 지장을 초래하고 삶의 질을 심각하게 저하시킨다. 파골세포는 뼈를 흡수하기 위해 하나의 세포에서 여러개의 다핵세포로 융합하는 분화과정을 거치며 이렇게 크게 융합된 다핵세포는 뼈의 표면에 붙어서 여러 신호전달을 거치면서 뼈를 흡수하게 된다. 본 논문에서는 파골세포의 뼈 흡수과정을 막아 골다공증 치료제로 발전시킬 수 있는 IPS-02001의 효과와 파골세포 신호전달 과정 중에 새로운 단백질인 TSPAN7을 막을 수 있는 TSPAN7-Fc의 효과를 연구하였다. 또한 파골세포에만 관련되어있다고 생각한 OSCAR를 없앴을 때 무릎관절의 연골에서 어떠한 변화가 일어나는지를 OSCAR를 없앤 형질전환 생쥐를 이용하여 연구하였다. 논문의 첫 번째 장에서는 파골세포의 integrin αvβ3 과 뼈의 RGD 구조를 막아 뼈가 파괴되는 과정을 막을 수 있는 새로운 약인 IPS-02001에 대해 연구하였다. IPS-02001은 단백질과 단백질 사이의 연결을 대상으로 하여 막는 약으로서, computer-aided drug design (CADD)를 통해서 만들었다. IPS-02001을 파골세포가 분화할 때 처리하면 분화를 억제하지는 않지만 파골세포가 크게 융합되기 위해 이동하는 것을 막고 그 기능인 뼈의 흡수를 막는다. 이는 IPS-02001이 integrin αvβ3 를 막음으로써, integrin αvβ3의 잘 알려진 기능인 파골세포가 크게 형성될 때 링 구조를 만들어주는 것을 저해시켜 파골세포의 뼈 흡수 기능을 막는다. 또한 IPS-02001을 처리했을 때 뼈 흡수와 링 구조 형성 신호전달물질인 Pyk2, c-Src, PLCγ2, Vav3가 억제되었다. IPS-02001을 치료제로 사용하기 위해 동물실험을 하였을 때, RANKL을 주입하여 부분적으로 뼈가 파괴되도록 만든 뒤 IPS-02001을 처리하는 실험과 난소절제수술을 통하여 골다공증을 유발시키고 IPS-02001을 처리하는 실험 모두 뼈의 파괴가 감소하고 수술로 인한 감소된 뼈의 밀도도 회복되었다. 그러므로 IPS-02001은 파골세포의 기능적 문제가 관련된 뼈 질환에서 뼈 흡수 억제제로서 새로운 치료제가 될 수 있다. 논문의 두 번째 장에서는 TEM이라 불리는 특징적인 막 도메인에서 발현되는 TSPAN7 단백질에 관련된 연구로서 TSPAN7은 파골세포의 융합과 기능에 중요하다. 우리는 인간 항체의 Fc 부분과 TSPAN7의 integrin 같은 다른 단백질과 결합을 하는데 중요한 역할을 한다고 알려진 막 바깥의 구조 (EC2 domain)를 결합하여 새로운 TSPAN7 억제제를 만들었다. 앞서 말한대로 파골세포에는 integrin αvβ3 이 뼈 흡수 기능에 중요한 역할을 한다. TSPAN7-Fc를 파골세포가 분화할 때 처리하면 분화는 되지만 파골세포가 크게 성숙하는 것을 저해하고, 뼈를 흡수하는 기능을 억제한다. 또한 TSPAN7-Fc를 치료제로 사용하기 위해 동물실험을 하였을 때, LPS를 주입하여 부분적으로 뼈가 파괴되도록 만든 뒤 TSPAN7-Fc를 처리하는 실험과 난소절제수술을 통하여 골다공증을 유발시키고 TSPAN7-Fc를 처리하는 실험 모두 뼈의 파괴가 감소하고 수술로 인한 감소된 뼈의 밀도도 회복되었다. 특히 두 실험 모두 파골세포의 모양이 정상적이지 않은 것으로 보아 이런 억제 효과는 TSPAN7-Fc를 처리하였을 때 파골세포가 비정상적인 모양으로 분화가 되어 그 기능을 상실함으로써 골 흡수 정도가 감소하고 그로 인해 골다공증 같이 뼈의 밀도가 감소되는 것을 억제하는 것으로 보인다. 그러므로 TSPAN7-Fc는 파골세포의 기능적 문제가 관련된 뼈 질환에서 뼈 흡수 억제제로서 새로운 치료제가 될 수 있다. 논문의 세 번째 장에서는 파골세포에 특이적으로 발현된다는 OSCAR 단백질이 퇴행성 관절염을 통한 무릎 관절의 연골에서 어떠한 영향을 미치는지 연구하였다. 퇴행성 관절염은 보편적으로 많이 알려진 관절 질병으로 많이 알려진 것이 없어 효과적인 치료법이 나와있지 않다. 우리는 OSCAR가 콜라겐의 수용체라는 것에 착안하여 OSCAR가 없도록 형질전환 된 생쥐를 사용하여 퇴행성 관절염 실험을 하였다. 실험적으로 퇴행성 관절염을 유발시켰을 경우 정상 생쥐의 연골이 파괴되는 것에 반해 파괴 정도가 줄어들었다. 또한 퇴행성 관절염이 유발되면 연하골 플레이트의 두께가 얇아지고 연골이 석회화 된다고 알려져 있는데 OSCAR 형질전환 생쥐에서는 정상 생쥐에 비해 이 증상들도 모두 완화되었다. 특히 나이가 듦에 따라 정상 생쥐에 비해 연하골 플레이트의 두께는 감소되어 있었고 연골 석화 정도도 줄어들었다. 또한 나이에 따른 자연스러운 퇴행성 골다공증도 OSCAR 형질전환 생쥐에서는 일어나지 않았다. 치료적인 효과를 보기 위해 앞서 TSPAN-FC를 만든 것과 같이 OSCAR-Fc 단백질을 만들어서 정상 생쥐에 퇴행성 관절염을 유발한 뒤 OSCAR-Fc를 처리하였을 때 관절염이 더 이상 진행되지 않았다. 게다가 퇴행성 관절염이 유발될 때 연하골에서 많이 발현된다는 TGF-β1이 OSCAR 형질전환 생쥐에서는 정상쥐에 비하여 적게 발현되었다. 결론적으로, 연하골에서 OSCAR가 없는 것은 퇴행성 관절염에서 병리학적인 변화를 가져오고, 이 과정은 퇴행성 관절염 치료에 있어서 새로운 접근방법이 될 수 있다.