기능을 강화시킨 편도 유래 중간엽 줄기 세포를 이용한 염증성 장질환 치료 효과 연구

Abstract

목적: 염증성 장질환은 장관에 원인미상의 만성염증을 일으키는 질환으로 악화와 호전을 반복하면서 진행하는 임상경과를 보이며 궤양성 대장염과 크론병이 그 대표적인 질환이다. 줄기세포 치료는 최근 염증성 장질환을 비롯한 다양한 면역 불균형에 의해 유발된 질환에서 치료제로서 연구되며 여러 임상시험 중에 있다. 편도 유래 중간엽 줄기세포는 줄기세포의 고유 기능을 모두 가지며 채취가 용이하고 획득하는 세포의 수가 충분하다는 장점이 있다. 선행 연구에서 DSS유도 급성 및 만성 장염 동물모델에서 편도 줄기세포와 그 배양액의 투여는 염증정도를 개선시켰으며, 염증성 사이토카인의 분비 또한 줄어드는 효과를 보였다. 이에 본 연구에서는 몇 가지 화학적, 물리적 전처치를 통해 기능이 강화된 편도줄기세포를 배양한 후 이를 동물실험에 적용시켜 그 효과를 알아보고자 하였다. 방법: 편도줄기세포의 효능을 증대시키기 위한 전처치 물질로 메포민과 아스코르빅 에시드가 사용되었으며, 배양방법을 3차원으로 시도해 보았다. 전처치로 인한 편도줄기세포의 분석을 위해 cell proliferation assay와 real- time PCR을 통한 mRNA 발현 변화를 비교하였으며, 산화 및 염증 스트레스 하에서 편도줄기 세포의 변화를 측정하였다. 또한, 동물실험에서는 B6 마우스를 대상으로 급성 및 만성 장염을 유도한 후, 전처치 된 편도줄기세포를 복강 내 투여하여 그 효과를 비교 분석하였다. 육안적 평가로는 질병활성도와 장 길이를 비교하였으며, H&E 염색으로 조직을 관찰하였고, 대장 조직의 염증성 사이토카인의 분석은 real- time PCR을 통하여 분석하였다. 결과: 편도줄기세포에 메포민과 아스코르빅 에시드를 농도 별로 처리하여 세포의 증식력을 보았을 때, 0.2 mM농도에서 증식력이 증가하였으며, H2O2와 LPS를 처리하여 산화 및 염증 스트레를 만들어 준 후 전처치를 하여, 세포의 생존력을 측정하였을 때 0.2 mM농도에서 생존 능력이 회복됨을 보였다. 동물실험에서는 3차원 입체배양을 통한 편도줄기세포를 투여하였을 때 급성 및 만성 장염 동물 모델에서 DAI와 장 길이의 호전을 보였으며, 전 염증 사이토카인의 발현도 감소함을 보였다. 결론: 편도줄기세포에 화학적, 물리적인 전처치를 통하여 좀 더 기능 강화된 줄기세포를 만들어 보았다. 화학적인 전처치를 통하여 자라는 속도와 염증 및 산화스트레스에서 견디는 힘을 더 강화시킨 편도줄기세포를 동물실험에 적용시켜 보았을 때는 그 효과가 미미 하였지만, 3차원 입체배양을 통해 더 단단한 구조를 만들어 동물에 투여하였을 때에는 기존에 효과가 있었던 편도줄기세포 투여 군 보다도 더 좋은 효과를 나타내었다. ;Background We previously had demonstrated that intraperitoneal administration of TMSCs (Tonsil-derived mesenchymal stem cells) improve the disease activity and downregulate expression levels of pro-inflammatory cytokines in dextran sulfate sodium(DSS)-induced animal colitis models. In this study, we aimed to develop and verify new experimental methods of TMSC transplantation. To inhibit the pro-inflammatory effect and maximize the therapeutic function, we pre-treated TMSCs with metformin (met) and ascorbic acid (AA2P). 3D-culture of TMSCs was designed to induce the aggregation of cells expecting to effectively maintain its inherent properties of stem cells and enhance its differentiation and replication potentials after the transplantation. Methods In vitro, proliferation and viability effects of pretreated TMSC were confirmed by CCK-8 assay. To confirm the change in the molecular levels of pretreated TMSC was performed real-time PCR. In vivo, eight-week-old C57BL/6 mice were randomly assigned into normal, colitis, no pretreated TMSCs (non-TMSC), metformin pretreated-TMSCs (met-TMSC; 0.2mM), ascorbic acid pretreated-TMSCs (AA2P-TMSC; 0.2mM) and 3D-cultured TMSCs (3D-TMSC, 1,400cells/spheroid, 800 spheroids) groups. TMSCs was administered via intraperitoneal injection 2 times. The severity of colitis was assessed by measuring the disease activity index (DAI), colon length, and cytokine levels of each mice. Results In vitro, pretreatment of 0.2mM metformin (108.4 ± 1.5 vs. 100.0 ± 1.4, met-TMSC vs. non-TMSC, p = 0.003) and 0.2mM ascorbic acid (119.2 ± 1.6 vs. 100.0 ± 1.4, AA2P-TMSC vs. non-TMSC, p < 0.001) increased TMSC proliferation. In the DSS-induced colitis model, the met-TMSC and AA2P-TMSC group showed not significant difference of DAI with the non-TMSC group at day 30. (5.4 ± 2.5 and 5.6 ± 2.6 vs. 5.8 ± 2.5, respectively, p = 0.917, p = 0.958. However, the 3D-TMSC group showed a significant DAI reduction than the 2D-TMSC group (1.2 ± 0.4 vs. 5.8 ± 2.5, p =0.003). The 3D-TMSC group is the best effect for the recovery of weight change and colon length. Conclusions In this study, we investigated the treatment effect of functionally enhanced TMSCs administrated to the IBD mouse model. The 3D- culture method showed the best effect. Future studies will require more effort to apply the cultured TMSCs to IBD treatment.