Identification and characterization of a novel tumor suppressor gene and oncogenic fusion gene in lung adenocarcinoma

Abstract

Lung cancer is the primary cause of cancer-related deaths worldwide. Lung adenocarcinoma (LUAD) is a subtype of non-small-cell lung cancer (NSCLC) which is one of two main histological types of lung cancer and accounts for more than half of all lung cancers. Despite improvements in therapeutic efficacy, the overall 5-year survival rate remains at around 15 percent. Therefore, it is important to identify new therapeutic strategies. From whole-transcriptome sequencing of 102 LUAD tumors, a new candidate tumor suppressor, SLC6A4 (Solute Carrier Family 6 Member 4) and an oncogenic fusion gene consisting of VAMP2 (Vesicle-Associated Membrane Protein 2) and NRG1 (Neuregulin 1) have been isolated and functionally characterized in this study. SLC6A4 encodes an integral membrane protein that transports the neurotransmitter serotonin (5-HT) from synaptic spaces into presynaptic neurons and plays a key regulatory role of extracellular serotonin levels by re-uptaking serotonin. Although SLC6A4 has been extensively studied in depressive disorders, it is unclear what roles SLC6A4 plays in cancer development. The gene is down-regulated in LUAD patients and inhibited cell growth through the cell cycle arrest and induction of apoptosis in the presence of serotonin in lung cancer cell lines. I also profiled gene expression alterations induced by serotonin and propose involvement of several transcription factors including p53 in cell cycle arrest. NRG1 has been discovered as the tail moiety of fusion genes with several distinct partner head genes in lung cancers. These fusion genes activate ERBB2/ERBB3 receptor-mediated cell signaling and thereby function as oncogenic drivers. RT-PCR and genomic DNA analysis were used to demonstrate inter-chromosomal translocation in LUAD patient. The most highly expressed splice variant (VAMP2–NRG1-I-β3) of VAMP2-NRG1 fusion gene was shown to be membrane-bound and displayed EGF-like domain of NRG1 extracellularly. VAMP2–NRG1-I-β3 enhanced the cell growth through ERBB2/ERBB3 signaling pathway in H1568 lung adenocarcinoma cells. VAMP2-NRG1 is a novel oncogenic fusion gene representing a new addition to the list of NRG1 fusion genes which together may form an important diagnostic and clinical category of lung adenocarcinoma cases.;폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이다. 폐 선암 (Lung adenocarcinoma; LUAD)은 폐암의 두 가지 주요 조직형 중 하나인 비소 세포 폐암 (Non-small cell lung cancer; NSCLC)의 하위 유형이며 모든 폐암의 절반 이상을 차지한다 (Pao and Girard, 2011). 기존의 수많은 연구를 통한 치료 효과 향상에도 불구하고 아직 폐암환자의 생존율은 매우 낮다. 그러므로 새로운 치료 전략을 연구하는 것이 중요하다. 본 연구에서는102명의 폐 선암 환자 조직을 이용한 전체 전사체 시퀀싱 (whole-transcriptome sequencing)을 통하여 새로운 후보 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene)인 SLC6A4 (Solute Carrier Family 6 Member 4)를 발견했다. 또한, VAMP2 (Vesicle-Associated Membrane Protein 2)와 NRG1 (Neuregulin 1)로 구성된 새로운 발암 융합 유전자 (fusion gene)를 발견하였으며 이들의 기능을 실험적으로 검증하였다. SLC6A4는 신경 전달 물질 인 세로토닌을 시냅스 영역에서 시냅스 전 뉴런으로 이동시키는 필수 막 단백질을 발현하며 세포 외 세로토닌 농도를 조절하는 역할을 한다. SLC6A4는 우울 장애에서 광범위하게 연구되어 왔지만 암에 관련해서는 어떤 역할을 하는지 명확하지 않다. 본 연구에서는 RNA 시퀀싱을 통해 이 유전자가 폐 선암 환자의 종양조직에서 발현이 매우 낮은 것을 확인하였다. 폐암 세포주에서 이 유전자의 기능을 시험한 결과, 과발현 시켰을 때 세로토닌을 처리한 경우 세포주기 정지 및 세포 사멸이 유도되어 세포 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 또한 폐암 세포주에서 세로토닌에 의한 유전자 발현 변화를 분석하였고, SLC6A4와 세로토닌에 의한 세포주기 정지에서 p53을 비롯한 여러 전사 인자의 관련성을 제시하였다. NRG1은 폐암에서 여러 가지 파트너 헤드 유전자를 가진 융합 유전자의 꼬리 부분으로 발견되었다. 이러한 융합 유전자는 ERBB2/ERBB3 수용체 매개 세포 신호전달을 활성화시켜 종양 유발 인자로서 기능한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)과 유전체 (genomic DNA) 분석을 통하여 폐 선암 환자에서 염색체 간 전이를 증명하였다. VAMP2-NRG1 융합 유전자의 스플라이스 변이체 (splice variant) 중에서 폐암에서 가장 많이 발현된 형태인 VAMP2-NRG1-I-β3는 세포 막에 결합하는 단백질로, 면역 형광법 (immunofluorescence)을 통해NRG1의 EGF 유사 도메인이 세포 외 위치하는 것을 확인하였다. 또한, VAMP2-NRG1-I-β3가 폐 선암종 세포인 H1568에서 ERBB2/ERBB3 신호 전달 경로를 활성화하여 세포 성장을 촉진시키는 것을 확인하였다. VAMP2-NRG1은 NRG1 융합 유전자의 목록에 새로 추가 된 새로운 발암 성 융합 유전자로서 폐 선암종의 중요한 진단 및 임상 분류를 형성 할 수 있다.