Crystal structures and inhibitor assays of enzymes involved in the heptose, CMP-KDO biosynthesis pathways from Burkholderia Pseudomallei and B.thailandensis

Abstract

본 논문은 류비저를 일으키는 병원균인 Burkholderia pseudomallei 의 heptose 와 CMP-KDO 생합성에 관계된 효소들의 저해제를 개발하기 위한 목적으로 효소들의 삼차원구조를 규명한 연구 내용을 다루고 있다. Heptose 와 CMP-KDO 의 생합성이 방해되면 미생물들은 감염성을 잃게 되고 항생제에 대한 감수성이 증가하게 된다. 그러므로 이러한 생합성 경로에 관계된 효소들을 대상으로 한 저해제가 개발되면 새로운 항생제나 이미 알려진 항생제의 작용을 극대화 시키는 항생제 보조제의 기반이 될 수 있다. 이를 위하여 이 경로에 관계된 효소의 삼차구조와 기능을 규명하고 효소들에 대한 assay 방법도 개발하였다. Ligation Independent Cloning 을 이용한 표적 단백질 클로닝 방법을 통하여 B. pseudomallei 의 ADP-Heptose 생합성에 관계된 효소 HldE2 와 GDP-heptose 생합성에 관계된 세 개의 효소 HddC, WcbK, WcbJ 유전자를 확보하였다. 추가적으로 B. pseudomallei 의 CMP-KDO 생합성에 관계된 다섯 개의 효소 RpiA, KdsF, KdsA, YrbI, KdsB 도 모두 클로닝을 통하여 유전자를 확보하였다. 또한 류비저균(Bp) 외에 감염성이 없는 Burkholderia thailandensis(Bt) 의 연구도 수행하였다. 이 효소들은 다양한 분리 정제 방법을 통해 대량발현 되고 고농도의 순수 단백질 용액을 얻게 되었다. Dynamic Light Scattering test 를 통하여 단백질 conformation 의 균일성을 확인하였다. 결정화 로봇인 Hydra plus one crystallization robot 을 통하여 초기 결정화를 거쳐 생성된 결정들을 grid refinement 방법을 이용하여 개선하였다. 회절을 잘 하는 단백질 결정의 X-선 회절자료를 Coot, PHENIX 등의 program 을 이용하여 삼차원 구조를 규명하였다. 결정화를 통해 얻은 8개의 단백질 결정 중 5종류 효소의 삼차원 구조를 규명하였다. 각 효소들의 활성을 확인하기 위해 이 생합성에 관계된 모든 효소들을 분리하여 in vitro 에서 단계별 효소의 조합을 통하여 효소 반응을 유도하였다. Liquid chromatography-Mass spectrometry 를 이용한 in vitro assay 방법을 개발하여 효소 반응을 통해 생성된 기질 및 생성물을 분석하였다. 이를 통하여 Lipopolysaccharide 에서 core oligosaccharide 를 형성하는 ADP-heptose 와 CMP-KDO 생성에 관계된 효소들 및 O-antigen 을 형성하는 GDP-heptose 생성에 관계된 효소들의 연속적인 assay 방법을 구축하였다. 본 연구결과는 효소의 구조와 기능을 명확하게 밝히고 효소의 활성을 측정하는 assay 의 개발을 통해 단백질의 특성을 규명한다는 점에서 학문적으로 매우 중요하다. 슈퍼박테리아로 인한 다제내성 문제 때문에 새로운 항생제의 개발이 쉽지 않은 상황에서 이러한 연구들은 새로운 항생제나 항생제 치료 보조제를 개발하는 대안이 될 수 있다. 또한 B. pseudomallei 는 생화학 전에 사용 가능하기 때문에 생화학전이나 세균 테러에 대비함에 있어서도 의의를 가진다. 마지막으로 동남아시아, 호주북부 등 열대지역으로의 여행자 및 근로자가 늘고 있는 시점에서 치료제의 개발은 국민 건강을 위하는 차원에서도 중요한 의미가 있다.;This thesis has focused on developing inhibitors targeting enzymes involved in the heptose and cytidine 5’-monophosphate-3-deoxy-manno-octulosonate (CMP-KDO) biosynthesis pathways from pathogenic microbe Burkholderia pseudomallei. If these pathways are blocked, many of microbes lose their pathogenicity and become more sensitive to antibiotics. Therefore, inhibitors targeting these biosynthesis pathways can be used as templates for new antibiotics or adjuvants maximizing antibiotic efficiency of known antibiotics in co-treatment therapy. In order to achieve this goal, X-ray crystallography and biochemical assay methods have been designed and employed. The ligation independent cloning method was employed to get cDNA of HldE2 involved in the ADP-heptose and three genes of HddC, WcbK and WcbJ from the GDP-heptose biosynthesis were cloned. In addition, six more genes of RpiA, KpsF, KdsA, YrbI, KdsB from the cytidine 5’-monophosphate-3-deoxy-manno-octulosonate (CMP-KDO) biosynthesis were also cloned. All of these genes were from B. pseudomallei or B. thailandensis with no pathogenicity. These enzymes were overexpressed and well purified using several chromatographic methods. The homogeneity of proteins was checked using a dynamic light scattering machine. The initial crystallization was performed using Hydra plus one crystallization robot and initial crystals were further refined manually using a grid refinement method. The X-ray data of good quality crystals were collected and their crystal structures were determined using Coot and PHENIX. Out of eight crystals, three-dimensional crystal structures of five different enzymes have been determined. In order to build a robust and convenient assay method, a sequential assay method in which all of enzymes in the same pathway are mixed together has been employed. The reaction products were confirmed using Liquid chromatography-Mass spectroscopy. Using this novel approach, robust assay methods to identify functions of enzymes producing ADP-heptose and CMP-KDO, an essential component of core oligosaccharides, and GDP-heptose, a building block of O-antigen units, were established. This study has an academic importance in terms of structure-function relationship of enzymes and development of enzyme assay methods. Since there is a serious multi-drug resistant problem caused by super bugs, this kind of approach targeting the heptose and CMP-KDO biosynthesis pathways can be an alternative way to develop new antibiotics or antibiotics adjuvants. Apart from this, B. pseudomallei is classified as a bioterrorism B agent usable to bio-warfare. Therefore, development of specific antibiotics against melioidosis is essential to cope with a potential disastrous situation such as bio-terrorism. This kind of antibiotics will be also beneficial to public health in near future since economic trade and tourism are increasing with south Asian countries where melioidosis is endemic.