Characterization of the Biosynthetic Route to FK506 and Mutasynthesis of FK506 Analogues

Abstract

FK506은 면역억제활성을 갖고 있는 폴리케타이드로 다양한 Streptomyces 종에서 생산된다. 이는 장기 이식 환자의 이식거부반응 예방과 아토피성 피부염과 같은 자가면역질환의 치료제로 사용되고 있다. FK506 생합성에 관여하는 유전자들은 보고되어 있으나, FK506의 아릴기 (allyl functional group)와 post-PKS 변형에 관한 정확한 생합성 메커니즘은 밝혀지지 않았다. 본 연구는 FK506의 아릴기 생성에 관여하는 allylmalonyl-CoA의 생합성 경로 및 FK506의 생합성에 필수적인 post-PKS 변형 경로를 규명하는 것을 목표로 하였다. 또한 돌연변이합성법 (mutasynthetic approach)을 이용하여 FK506의 아릴기 또는 스타터 유닛 (starter unit)이 변형된 신규 유도체를 생산하고자 하였다. 본 논문의 3장에서는 3종의 FK506 생합성 유전자 집단을 화학, 생화학, 유전자 수준에서 분석함으로써 allylmalonyl-CoA의 생합성 경로를 최초로 규명하였다. 폴리케타이드 계열 화합물에 있어서 독특한 구조이며, 활성에도 중요한 역할을 하는 아릴기 생성에 관여하는 allylmalonyl-CoA는FK506 생합성 유전자 집단과 분리된 폴리케타이드 합성효소가 숙주의 지방산 합성효소와 협력하여 trans-2-pentenyl-ACP를 통해 생합성됨을 밝혀냈다. TcsB는 propionyl-CoA에 의해 아실화 (acylation)된 KS 도메인 (domain)으로 TcsA에 로딩 (loading)된 malonate와의 축합반응에 관여한다. 이로 인해 만들어진 ACP에 붙은 β-keto-pentanoate는 trans-2-pentenyl-ACP로 변형되는데 이는 균주 내의 지방산 생합성 시스템에 의해 이루어지는 것으로 추측하고 있다. 후속 반응은 propylmalonyl-ACP가 생성되는 환원성 카르복실화 (reductive carboxylation) 과정으로 TcsC에 의해 이루어진다. 마지막으로 TcsD 작용에 의해 allylmalony-ACP가 생합성되고, 이는 allylmalony-CoA의 형태로 FK506 PKS의 네번째 모듈 (module)에 로딩됨으로써 최종적으로 FK506이 생합성된다. 본 연구결과는 FK506 생합성 유전자 집단과 분리된 폴리케타이드 합성효소에 의해 allylmalonyl-CoA가 생성되는 과정을 규명함으로써 폴리케타이드의 새로운 생합성 메카니즘을 제공하였다. 본 논문의 4장에서는FK506 중간체 분석 및 사이토크롬 P450 수산화효소인 FkbD와 메틸전이효소인 FkbM의 in vitro 효소반응을 통해FK506의 생합성을 위한 post-PKS 변형 경로를 규명하였다. 이를 통해 FK506의 생합성을 위해 두가지의 독립적인 생합성 경로가 존재함을 확인하였다. 본 생합성 경로에는 9-deoxo-FK506 중간체인 9-deoxo-31-O-demethyl-FK506과 9-deoxo-FK506가 존재하며, 이들은 FkbD의 기질로 사용됨을 확인하였다. 또한 FkbM은 31-O-demethyl-FK506 중간체인 31-O-demethyl-FK506과 9-deoxo-31-O-demethyl-FK506을 기질로 사용함을 확인하였다. FK506의 post-PKS 변형 경로의 규명을 통해 지금까지 알려지지 않은 새로운 FK506 생합성 중간체들을 발견하였을 뿐만 아니라 FK506의 최종 생합성을 위해서는 두가지의 평행경로 (parallel pathways)가 존재함을 보여주었다. 마지막으로 본 논문의 5장은 독성은 줄이고 유용한 생물학적 활성은 유지되는 FK506의 유도체를 생산하기 위한 연구를 다루고 있다. FK506은 매우 복작한 구조적 특성 때문에 화학적 방법을 통한 구조 변형에 다양한 어려움이 존재한다. 이에 본 장에서는 유전자 조작된 FK506 생산균주에 비천연 생합성 전구체들을 첨가하여 배양하는 방법인 돌연변이합성법을 통해 FK506의 새로운 유도체를 생합성하였다. 특히 FK506의 탄소 21번 위치의 아릴기와 사이클로헥산 구조 (cyclohexane ring)은 생물학적 활성에 중요한 역할하는 부위로 알려져있다. 이들의 생합성 과정의 이해는 탄소 21번 위치의 곁사슬 또는 스타터 유닛이 변형된 FK506 유도체의 생산을 가능하게 하였다. 먼저, 탄소 21번 아릴 곁사슬의 생합성에 관여하는 tcsB 유전자를 결손화한 돌연변이주에 다양한 카르복실산을 첨가하여 배양하였을 때 탄소 21번 곁사슬이 변형된 36-methyl-FK506과 36-fluoro-FK520이 생산되었다. 또한 이와 비슷하게 FK506의 스타터 유닛의 생합성에 관여하는 fkbO 유전자를 결손화 돌연변이주에 3-사이클로헥센-1-카르복실산 (3-cyclohexene-1-carboxylic acid)을 첨가하여 배양하였을 때 32-dehydroxy-FK506이 생산되었다. 돌연변이합성법을 이용하여 생산된 3종의 FK506 유도체들은 면역억제 및 신경재생활성을 검정함으로써 유용 생리활성물질로의 활용이 가능함을 확인하였다. 본 연구에 이용된 돌연변이합성법은 FK506의 구조적 다양화 및 향상된 활성을 가지는 신규 유도체를 효율적으로 개발할 수 있음을 보여주었다. 이상의 연구 결과는 폴리케타이드 계열 화합물인 FK506의 allylmalonyl-CoA 생합성 경로 및 post-PKS 변형 경로의 메커니즘을 규명하는 한편, 돌연변이합성법을 이용하여 향상된 신경재생활성을 보이는 신규한 FK506 유도체의 생합성에 관한 보고이다. 이와 같은 FK506 생합성의 독특한 특성은 FK506 유도체뿐만 아니라 마크로라이드 구조 (macrolide scaffold)의 조합생합성에 대한 새로운 전략을 가능하게 하며, 향후 폴리케타이드 계열의 신규 유도체 생산에 다양하게 적용되어 새로운 천연물 의약품 유도체를 효율적으로 개발하는데에 이용될 수 있을 것으로 예상된다.;FK506 is a 23-membered macrocylic polyketide with immunosuppressant activity produced by a variety of Streptomyces species, used to prevent rejection of transplanted organs and in the treatment of autoimmune diseases such as atopic dermatitis. Although the genes involved in formation of FK506 were reported, the exact biosynthetic mechanisms of the allyl functional group and post-polyketide synthase (PKS) modification have unresolved. The main focus of the present study was to characterize the biosynthetic pathway of allylmalonyl-coenzyme A (CoA), from which the FK506 allyl group is derived, and the post-PKS modification pathways in FK506 biosynthesis. Furthermore, characterization of FK506 biosynthetic pathway facilitated the engineered biosynthesis of novel allyl group or starter unit-modified FK506 analogues using the mutasynthetic approach. Chapter I gives a brief overview of polyketide immunosuppressant, FK506. The Materials and Methods section of Chapter II provides technical information to elucidate FK506 biosynthetic pathway and generate the novel FK506 analogues. In chapter III, the detailed biosynthetic pathway of allylmalonyl-CoA was characterized based on the comparison of three FK506 gene clusters, gene deletion, chemical complementation and biochemical analysis. A discrete PKS with noncanonical domain architecture presumably in coordination with the fatty acid synthase pathway of the host catalyzes a multi-step enzymatic reaction to allylmalonyl-CoA via trans-2-pentenyl-acyl carrier protein (ACP). TcsB functions as a priming ketoacyl synthase (KS) acylated by propionyl-CoA and catalyzes the condensation with malonate loaded on TcsA. Most likely, the resulting ACP-tethered β-keto-pentanoate is converted into trans-2-pentenyl-ACP before the chain is further processed. The next reductive carboxylation reaction, giving propylmalonyl-ACP, is catalyzed by TcsC. Finally, TcsD catalyzes the reaction to allylmalonyl-ACP, which is subsequently loaded onto module 4 of FK506 PKS through allylmalonyl-CoA. This study provides new polyketide biosynthetic machinery that incorporates the atypical extender unit generated by a dedicated PKS into the main modular PKS. In chapter IV, the post-PKS modification pathways in FK506 biosynthesis were detailed through the identification of all intermediates and in vitro enzymatic reactions of the cytochrome P450 hydroxylase FkbD and the methyltransferase FkbM. The results clearly demonstrate that there are two independent biosynthetic routes to FK506, and it has been shown that 9-deoxo-FK506 derivatives, 9-deoxo-31-O-demethyl-FK506 and 9-deoxo-FK506, can be used as substrates for FkbD, whereas FkbM can utilize 31-O-demethyl derivatives, 31-O-demethyl-FK506 and 9-deoxo-31-O-demethyl-FK506 as substrates. The detailed understanding of the post-PKS modification steps for the biosynthesis of FK506 has allowed us to discover the new biosynthetic intermediates and remarkable parallel pathways leading to FK506. Extensive chemical modifications have been conducted to identify derivatives of FK506 with similar efficacy but with reduced toxicity. However, specific chemical modification of these molecules is often impractical due to their structural complexity. Precursor-directed biosynthesis or mutational biosynthesis can allow the production of more structurally modified analogues of these molecules. In chapter V, the novel analogues of FK506 were biosynthesized when non-natural extender unit or starter unit were fed to the engineered producer of FK506. The C21 allyl moiety and the cyclohexane ring of FK506 are critical for its potent biological activity. Characterization of their biosynthetic pathways allowed us to generate several analogues of FK506 containing altered side chain at C21 or starter unit. The novel allyl group-modified FK506 analogues, 36-methyl-FK506 and 36-fluoro-FK520, were obtained through mutasynthesis by feeding cultures of Streptomyces sp. KCTC 11604BP tcsB (which is involved in the biosynthesis of C21 allyl side chain) deletion mutant with a series of carboxylic acids. The mutasynthetic approach also led to the generation of 32-dehydroxy-FK506 containing a non-natural starter unit by feeding a 3-cyclohexene-1-carboxylic acid to the fkbO (which is responsible for the biosynthesis of the starter unit) deletion mutant strain. In additions, the immunosuppressive and neurite outgrowth activities of FK506 analogues were evaluated. The mutasynthetic approach can be used to extend the structural diversity of FK506 and develop the novel agents with improved therapeutic properties. In summary, the unique features of FK506 biosynthesis illuminate a new strategy for the combinatorial biosynthesis of designer macrolide scaffolds as well as FK506 analogues.