Anti-inflammatory and anti-arthritic effects of Gintonin

Abstract

Gintonin is a newly derived glycolipoprotein from the roots of ginseng. The main constituents of Gintonin are lysophosphatidic acid (LPA) and protein. The lysophosphatidic receptor is known to be the high-affinity specific target receptor of Gintonin. Gintonin is known to control various intracellular processes and inhibit inflammation, but its mechanism in arthritis is not well determined. Arthritis is the destruction of cartilage and bone causing joint pain and edema, which can lead to the dysfunction of the affected joints. In the treatment of rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA), it is important to block the production of proliferating and inflammatory cytokines and proteases. Thus, much effort has been focused on developing treatments to block the generation of inflammatory cytokines and matrix metalloproteinases (MMPs). The purpose of this study is to investigate the anti-arthritic efficacy of Gintonin on various proteases and inflammatory mediators that have an important role in arthritis. To prove efficacy of Gintonin, in vitro experiments were conducted using LPS-stimulated RAW264.7 cells and interleukin (IL)-1β-stimulated fibroblast-like synoviocytes (FLS) derived from RA patients. The cells were treated with Gintonin (0.1, 1, 5, and 10 μg/ml) and stimulated with each stimulus 1 hour later. After treatment, the anti-arthritic efficacy of Gintonin was examined by analyzing the expression levels of inflammatory mediators such as IL-6, IL-8, cyclooxygenase (COX)-2, tumor necrosis factor (TNF)-α, prostaglandin E2 (PGE2) and MMPs using RT-PCR and ELISA. The phosphorylation of mitogen activated protein kinase (MAPK) pathways and translocation of nuclear factor kappa B (NF-κB)/p65 into the nucleus were also analyzed using western blot, ELISA, and immunocytochemistry. Two in vivo experimental models of arthritis were used in the study. The first model was the carrageenan/kaolin-induced arthritic rat model. The second arthritis model was a polyarthritis mouse model induced by collagen. Gintonin was orally administered at 25, 50, and 100 mg/kg/2 days. After administration, the weight, edema, pain, and arthritis index were measured. After sacrifice, general histological analysis was done through H&E staining and the degree of distributed cartilage throughout the joint was analyzed through safranin O staining. The levels of inflammatory mediators in the serum such as PGE2, TNF-α, and IL-6 were also measured through ELISA in carrageenan/kaolin-induced models. Gintonin inhibited the nuclear transfer of NF-κB/p65 in the IL-1β-stimulated FLS cells, inhibited expression of TNF-α, IL-6, IL-8, COX-2, PGE2, MMP-1 and MMP-13 and blocked the MAPK signaling pathway. In addition, the antioxidant effect of Gintonin was also shown using MitoSOX and 2’, 7’-Dichlorofluorescin diacetate (H2DCFDA) experiments. The two animal models induced by carrageenan/kaolin and collagen also showed the dose-dependent anti-arthritic efficacy of Gintonin on various behavioral parameters. Gintonin significantly reduced arthritic symptoms (e.g., erosion of pannus) and inflammatory cytokines. In particular, the destruction of cartilage, which is a major problem in arthritis, was found to be reduced in a dose-dependent manner. Gintonin also inhibited the expression of inflammatory cytokines in the serums obtained from each animal model. These results suggest that Gintonin has the potential to be a source of therapeutic drug for the treatment of arthritic symptoms of rheumatoid arthritis and osteoarthritis. ; 진토닌은 인삼에서 유래한 새로운 글리콜리포단백질이다. 진토닌의 주요 성분은 리소포인산(LPA)과 단백질이다. 리소포인산수용체는 진토닌의 특정 표적수용체로 알려져 있다. 진토닌은 각종 세포 내 작용을 조절하고 염증을 억제하는 것으로 알려져 있으나 관절염 억제에 대한 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 관절염은 연골과 뼈가 파괴되어 염증, 관절통, 부종을 일으키는 것으로, 관절의 기능 장애를 초래할 수 있다. 류마티스 관절염과 골관절염의 치료에서는 활막의 증식, 염증성 사이토카인, 프로테아제의 생산을 차단하는 것이 중요하다. 따라서 염증성 사이토카인 및 매트릭스 기질단백질(MMP)의 생성을 차단하기 위한 치료법 개발에 많은 노력이 집중되었다. 이 연구의 목적은 진토닌의 항산화, 항염증을 입증하고 최종적으로 항관절염 약효 검증이다. 관절염에 중요한 역할을 하는 여러 가지 보호막과 염증 매개체에 대한 진토닌의 항관절염 효능을 측정하기 위해 우리는 두 가지 세포주를 이용하여 시험관내 실험을 진행했다. LPS (100 ng/ml)로 자극된 대식세포와, 인터루킨(IL)-1β (10 ng/ml)로 자극된 류마티스관절염 환자로부터 파생된 섬유모세포양 활막세포가 사용됐다. 세포에 진토닌 (0.1, 1, 5, 10 μg/ml)으로 전처리를 하고 1시간 후, 각 세포의 자극제로 자극을 줬다. 자극 후, 진토닌은 NO, ROS의 활성을 억제시켰다. 진토닌의 항염, 항관절염에 관련한 약효는 RT-PCR과 western blot을 통해 iNOS, IL-6, TNF-α, COX-2의 염증 매개인자의 발현 수준이 감소함을 확인함으로써 증명되었다. 또한 MMP1, MMP13의 억제가 qRT-PCR을 통해 밝혀졌다. 진토닌의 항관절염에 대한 입증을 더욱 뒷받침 하기 위해서 우리는 두 가지 동물 모델을 사용하여 생체 외 실험을 수행했다. 첫 번째 모델은 카리지난/카올린으로 유도된 관절염 랫드 모델이다. 두 번째 관절염 모델은 콜라겐으로 유도한 다발성 관절염 마우스 모델이다. 진토닌은 25, 50, 100 mg/kg의 세가지 농도로 경구투여 되었다. 투여 후 체중, 부종, 통증, 관절염 지수를 측정해 각각 6일, 43일간 실험을 진행했다. 그 결과 진토닌은 유의하게 관절염의 발달과 증상 완화를 나타냈다. 각 모델로부터 얻어진 무릎 관절 조직을 이용해 H&E 염색과 safranin-O 염색을 통한 조직학적 분석 역시, 진토닌이 관절염 증상 완화에 효과적임을 나타냈다. 이어서, 우리는 각 모델의 혈액 내 염증 인자 수치를 ELISA를 이용하여 측정했다. 랫드 모델의 혈액에서 측정한 IL-6, TNF-α, PGE2는 진토닌 투여 그룹이 관절염 유발 그룹과 비교했을 때 현저히 감소했음이 확인됐다. 마우스 모델의 혈액 내에서는 IL-6와 G-CSF의 발현의 감소를 확인했다. 우리는 진토닌으로 치료하는 것이 전 염증성 사이토카인을 비롯한 다양한 스트레스 자극에 대한 직접적인 세포 반응에 주로 관여하는 MAPK 신호 전달 경로의 IL-1β유도성 활성화를 억제한다는 것을 발견했다. 실제로 진토닌 추출물은 JNK및 ERK1/2 MAPK 신호 전달 경로를 차단했고, IL-1β로 자극된 FLS에서 NF-κB/p65의 핵 전이를 억제 시켰다. 이것으로 MAPKs 신호 전달 차단을 통해 NF-κB/p65의 활성화 억제를 예상하게 한다. 이로써, 진토닌이 항산화, 항염증 효과에 이어서 항관절염에도 효과가 있음을 규명하였다. 진토닌의 항관절염 효과는 이 연구가 최초이며, 우리의 결과는 진토닌이 RA환자의 관절염 증상을 치료하기 위한 치료제 또는 식이 보충제로서의 가능성이 있음을 시사한다. 따라서 더 많은 진토닌의 항염증, 항관절염 효능에 대한 연구가 기대된다.