A role of AlkB homolog 5 (ALKBH5), an RNA demethylase, in early myogenesis

Abstract

Skeletal muscle is essential for movement and thermal homeostasis of our body. Ageing and idleness often cause loss of skeletal muscle mass and strength, leading to chronic illness often related with insulin resistance. Myogenesis, formation of muscle tissue, is a critical process for skeletal muscle development and maintenance. Myogenic induction is regulated by concerted regulation of transcriptional factors and epigenetic modulation. N6-methyladenosine (m6A), one of the RNA epigenetic modifications, is the most prevalent methylation in messenger RNA (mRNA). The modification modulates the export, splicing, or stability of mRNA. Recent studies suggested that m6A was involved in cell differentiation such as spermatogenesis and myogenesis. However, it has not been fully elucidated how m6A is involved. Here, we investigated a role of alkylation repair homolog 5 (ALKBH5), an alpha-ketoglutarate (α-KG)-dependent, m6A demethylase, in early myogenesis and its underlying mechanism. Firstly, a secondary analysis of publicly available microarray data from C2C12 models revealed that one of major differentially expressed gene sets during early myogenesis was oxidative phosphorylation-related gene set. In addition, α-KG-dependent, epigenetic modifiers were differentially. Among them, Alkbh5 expression was significantly upregulated after induction of differentiation, which was validated by quantitative PCR. Consistently, a relative low level of m6A was detected upon myogenesis by dot blots using an antibody against m6A. Next, immunofluorescence analysis showed that myotube length was increased by α-KG a cofactor for ALKBH5, while was hindered by succinate and fumarate, antagonistic metabolites for ALKBH5. We found that siRNA-mediated ALKBH5 knockdown prior to differentiation induction also inhibited myogenesis and significantly decreased expression of the myosin heavy chain 2 (MYH2) gene, a myogenic marker. Giemsa staining confirmed that the ALKBH5 knockdown significantly decreased myotube length in differentiated cells, indicating inhibition of myogenesis. Moreover, the effects of the knockdown were only observed when siRNA was transfected before or upon, but not after, differentiation induction, according to the results from immunofluorescence analysis. It indicated that ALKBH5 was involved in myogenesis at the early differentiation, not the later time point. Intriguingly, ALKBH5 downregulation enhanced adipogenic differentiation when the cells were induced by adipogenic media. Oil-Red-O staining analysis showed that ALKBH5-deficient C2C12 cells generated more lipid droplets than control C2C12 cells. The results together demonstrated that ALKBH5 was critical for a process of early myogenesis and its deficiency might lead to altered lineage decision from myogenesis toward to adipogenesis. This study provides the first evidence for the role of ALKBH5, in early myogenesis.;골격근은 우리 몸의 움직임과 열 항상성에 필수적이다. 노화와 신체 활동감소는 근육량 감소로 이어지고, 더 나아가 만성질환의 발병률이 높아질 수 있다. 근육 분화는 골격근 발달과 유지에 중요한 과정으로 근육 특이적인 전사인자의 연쇄적 발현과 후성유전학 기전에 의해 조절된다. N(6)-methyl-adenosine(m6A)는 후성유전학적 RNA 변형 중 하나로 mRNA에서 흔하게 나타나는 현상이다. 이는 mRNA의 스플라이싱, 안정성, 그리고 핵방출 등을 조절함으로써, 세포증식이나 분화에 관여할 수 있다고 보고되었다. 그러나 m6A가 세포분화, 특히 근육세포분화에 관여하는 기전연구는 거의 이루어진 바 없다. 따라서, 본 연구에서는 m6A 탈메틸화 효소인 ALKBH5가 초기 근육 분화에 어떠한 영향을 미치는 지를 연구하고자 하였다. 첫 번째로, 초기 근육 분화에 관련된 생물학적 경로와 후성유전학적 인자들을 알아보기 위해 이미 발표된 데이터를 2차 가공하여 Differential expression gene Genes (DEGs)와 Gene ontology(GO) term 기반한 경로 분석을 진행하였다. 그 결과, 초기 근육 분화 중 산화적 인산화 과정이 유의적으로 증가하며, 후성유전적 효소 중 Alkbh5 발현이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이 탈메틸화 효소인 Alkbh5의 발현 증가와 일관되게 초기 근육 분화 시 mRNA의 m6A 양이 감소하였다. siRNA를 이용해 Alkbh5 유전자 발현을 억제한 뒤 근육 세포 분화를 유도한 경우 근관세포의 수와 길이를 감소시켰다. 이 Alkbh5 발현 억제 효과는 분화 전 시점에서 억제하였을 때는 유의적이었으나, 분화 후 억제한 경우는 차이를 나타내지 않았다. Alkbh5 발현 억제는 근원세포의 세포증식에 영향을 주지 않은 반면, Myh2의 발현은 유의적으로 감소시켰다. 다음으로 근육 분화 시 활성화되는 산화적 인산화와 관련된 TCA 회로 대사물들이 근육세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 알파-케토글루타르산 의존적 효소인 ALKBH5의 활성을 억제할 수 있는 숙신산과 푸마르산 처리는 근관세포 길이를 유의적으로 감소시킨 반면, 조효소인 알파-케토글루타르산 처리는 근관세포 길이를 증가시켰다. 마지막으로, Alkbh5 억제 후 C2C12 세포를 지방세포 분화 유도하였을 때, 지방 축적이 촉진되었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, ALKBH5가 초기 근육 분화에 관여하고, 이 발현이나 활성을 억제할 경우 근육분화가 억제되었고, 지방분화는 오히려 촉진하는 경향을 보였다. 본 연구결과는 초기 근육 분화의 후성유전적 기전으로 RNA 탈메틸 효소인 ALKBH5의 관련성을 처음으로 보고하고, 더 나아가 세포 계통 결정에 관여할 수도 있다는 가능성을 제시하였다는데 의의가 있다. 그러나 본 연구는 제한적인 in vitro 증거만 제시하였으므로, 추가로 in vivo 증거가 요구되며, ALKBH5를 매개로 한 m6A의 변형으로 초기 근육 분화를 조절하는데 관여하는 표적 규명하기 위해서 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.