Studies on the antiplatelet activity of GKT137831 (Setanaxib), a NADPH oxidase inhibitor

Abstract

Platelets play a central role in hemostasis, thrombosis, vascular wound healing and several cardiovascular diseases. The interaction between collagen and platelet GPVI receptors is important in these processes. When collagen, one of components in extra cellular membrane binds to the GPVI receptor of platelets, reactive oxygen species (ROS) generation is increased and ROS promotes platelet activation. In platelet activation signaling, ROS acts as a second messenger, which amplifies various signaling cascade and triggers platelet aggregation. In GPVI-dependent ROS generation, the major ROS producing enzyme is nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADPH oxidase, NOX). Thus, NOX inhibitors can be a new antiplatelet agent candidates. GKT137831 (Setanaxib), NOX 1/4 dual inhibitor, has been entered into clinical trials for the first time among NOX inhibitors, but its effect on platelets has not been studied yet. In this study, I investigated the inhibitory effects of GKT137831 on ROS generation, protein phosphorylation in GPVI signaling pathway and platelet aggregation. GKT137831 significantly inhibited collagen-induced ROS generation in dosedependent manner. In stimulated platelets, ROS inhibits PTPs by oxidative inactivation and tyrosine dephosphorylation is reduced. As a result of this, the status of specific phosphorylation of key components (PLCγ2, ERK5 and p38 MAPK) in collagen-GPVI signaling pathway and phosphorylation of tyrosine of total proteins was significantly decreased by GKT137831 in dose-dependent manner. Also, GKT137831 reduced sub-step responses as P-selectin surface exposure and integrin αIIbβ3 activation. Aggregation of collagen-stimulated platelets was inhibited by GKT137831 in dose-dependent manner. GKT137831 inhibited the antiplatelet signaling NO/cGMP/PKG pathway from being reduced by ROS. In conclusion, GKT137831 exhibits antiplatelet effects through inhibition of ROS generation by NOX in collagen-induced activated platelets. This suggests GKT137831 could be developed as an antiplatelet agent for the prevention and treatment of plateletmediated cardiovascular diseases. ;혈소판은 거핵구 (megakaryocyte)에서 생성되는 가장 작은 지름을 갖는 혈액세포로, 체내에서 혈액 응고 과정에 작용하여 상처로 인한 혈관 손상 부 위의 지혈에 중요한 역할을 한다. 혈관이 손상되면 세포 외 기질이 노출되는 데, 여기에 존재하는 다량의 collagen이 혈소판의 glycoprotein VI (GPVI)수 용체에 결합하면서 혈소판이 활성화된다. GPVI 수용체 활성화 하에 일련의 신호 전달 과정이 일어나면서 혈소판 활성이 촉진된다. 활성화된 혈소판에서 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADPH oxidase, NOX)를 통해 활성 산소종 (Reactive oxygen species, ROS)의 생성이 증가 하며, 이들은 앞서 기술된 혈소판 활성화 신호 전달 과정에서 이차 신호 전달 자로 작용하여 신호를 증폭시킨다. 따라서 NOX 억제제는 활성 산소종의 감소 를 통한 항혈소판 기전을 가질 수 있다. GKT137831은 NOX 1/4 이중 억제 제로, NOX 억제제 중에서 최초로 임상 시험에 돌입한 물질이지만, 항혈소판 기전에 대한 연구는 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 collagen 자극으 로 활성화된 혈소판에 대한 GKT137831의 억제 작용을 활성 산소종 관련 신호 전달 경로를 중심으로 살펴보았다. Collagen에 의해 증가된 혈소판의 활성 산소종의 양은 GKT137831 전처 리 시에 농도 의존적으로 감소했다. 그 결과 활성 산소종에 의해 산화되어 억 제되었던 protein tyrosine phosphatase (PTP)의 활성이 회복되어 혈소판의 전체 단백질 및 collagen 수용체 신호 전달 경로의 주요 단백질 (PLCγ2, ERK5, p38 MAPK)의 특이적 tyrosine 인산화 정도가 감소하였다. 또한, GKT137831은 혈소판 응집과 부착에 중요하게 작용하는 P-selectin exposure 및 integrin αIIbβ3 활성화를 농도 의존적으로 억제했다. 최종적으 로, GTK137831은 collagen에 의한 혈소판의 응집반응을 농도 의존적으로 억제하였다. 또한, GKT137831은 NO/cGMP/PKG 신호 전달 경로를 통한 혈 소판 활성화 억제작용이 ROS에 의해 감소되는 것을 억제했다. 이상의 결과를 종합해보면, GKT137831은 collagen에 의해 활성화된 혈 소판에서 NOX를 억제하여 활성 산소종의 생성을 감소시키고, 이로 인한 일련 의 혈소판 활성화 과정을 억제하므로, 심혈관계 질환의 예방 및 치료의 새로 운 약물로 개발될 수 있다.