Development of Molecular Diagnostic Systems based on Isothermal Amplification of Dumbbell-shaped DNA probe

Abstract

Rolling Circle Amplification(RCA) is an isothermal amplification process that uses a circular DNA template, DNA polymerase and primers to generate long single stranded DNA products[1]. RCA is an attractive method for various applications in the diagnostics and therapeutics of nanobiotechnology. The advantages of simplicity and multi-functionality make it possible to use this approach for a variety of molecular diagnostics for the detection of nucleic acids (DNA, RNA), small molecules, proteins and cells[2]. Template DNA can be immobilized on various surfaces and amplified DNA products are easy to form large aggregates and hydrogels[4,5]. Single-stranded DNA with repeat units also allows the formation of special nano-structures such as G-quadruplex(G4)[3]. In this study, we proposed various RCA-based molecular diagnostic methods for nucleic acid detection. We developed a molecular diagnostic platform for the detection of bacterial RNAs causing sexually transmitted diseases (STD) and applied for a naked-eye detection using capillary tubes and magnetic beads for the point-of-care testing. The system has been confirmed its applicability in clinical samples. In addition to the RNA detection, we investigated the diagnosis of Epidermal growth factor receptor(EGFR) point mutation as a target for single nucleotide polymorphism (SNP) detection. To enhance its selectivity, a gap-filling process has been introduced. After the hybridization of target DNA to a dumbbell DNA probe, a gap filling process allowed a selective ligation of DNA probe only after single nucleotide filling by dNTPs(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) complementary to the mutant site. This approach allowed highly selective target recognition as compared to the conventional hybridization method. The various diagnostic platforms in this study will be promising and ideal alternatives in the molecular diagnostics market.;Rolling Circle Amplification(RCA)는 원형 DNA 주형, DNA 중합효소 및 프라이머를 사용하여 긴 단일 가닥의 생성물을 형성하는 등온 증폭 과정입니다. 단순성과 다기능성의 장점은 핵산(DNA, RNA), 소분자, 단백질 및 세포와 같은 다양한 분자진단을 가능하게 합니다. 긴 RCA 산물은 얽히기 쉽고 프라이머를 사용하여 템플릿을 다양한 분자에 고정시켜 증폭시킬 수 있습니다. 또한 반복 단위를 갖는 단일 가닥 DNA 산물은 G-quadruplex(G4)와 같은 특수 나노구조의 형성을 허용합니다. 본 연구에서는 핵산 검출을 위한 다양한 RCA 기반 분자진단 방법을 제안합니다. 우리는 성병을 유발하는 박테리아 RNA 병원체 진단 플랫폼을 개발하고 이를 현장진단에 이용하기 위하여 모세관과 자기 비드를 사용한 육안 진단 시스템에 적용했습니다. 이후 우리는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 진단의 대상으로 표피성장인자수용체(EGFR) 점 돌연변이를 선택하고 특이적 진단을 위한 갭 충전 시스템을 도입하였습니다. 표적과 프로브의 혼성화가 일어난 후, 돌연변이 부위에 상보적인 dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)에 의한 갭 충전 후에만 결찰이 진행되도록 합니다. 이는 매우 선택적 표적 인식이 가능합니다. 3시간 이내에 수행되는 빠른 진단은 비소세포폐암(NSCLC) 환자의 암의 수시 모니터링을 위한 이상적인 대안이 될 수 있습니다. 본 연구의 다양한 진단 플랫폼은 분자진단 및 현장진단 시장 내에서 다양한 감염병 및 비감염병 진단으로의 응용가능성을 보여줍니다.