Development of in vitro transcribed (IVT) mRNA system and its applications for protein expression and immunotherapy

Abstract

In vitro transcribed (IVT) mRNA is a promising alternative gene expression system to replace the conventional plasmid DNA vector. In this study, we have prepared the IVT mRNA and optimized the synthesis protocol to efficiently generate synthetic mRNA for applications in multiple-protein expression and immunotherapy. Expression of multiple proteins from a single vector is a highly attractive approach in the fields of biomedical applications. To achieve simultaneous expression of multiple proteins, 2A peptide sequences can be utilized for the development of a multicistronic mRNA system. [13] Unlike the Internal Ribosome Entry Site (IRES) based multiple protein expression system, 2A peptide is known for high cleavage efficiency results equivalent expression ratio of multi-proteins in a single vector. Three distinct fluorescent proteins (GFP, RFP, BFP) were translated using a single IVT mRNA. Despite the confirmation of self-cleavage effect of 2A peptide, the expression of downstream gene was not sufficient. Further studies are required to determine the effect of type of 2A peptides. mRNA-based vaccines have drawn much attention and become anticipated therapeutics in the near future. Since IVT mRNA has limitation in contact with biological fluids in vivo, formulation strategy is highly required. Especially, mRNA formulated into lipid nanoparticle (LNP) has been tested in several infectious diseases and cancer immunotherapy. Here, we have developed adjuvant incorporated LNP formulations to evaluate cancer immunotherapeutic effect. We confirmed that Pam3 can be a powerful immunoadjuvant in our system. However, further studies are required to identify detailed mechanism of overall immune responses against variety of antigens or adjuvants. ; In vitro transcribed (IVT) mRNA는 통상적인 플라스미드 DNA 벡터를 대체하기 위한 유망한 유전자 발현 물질이다. 이 연구에서 우리는 여러 단백질 발현 및 immunotherapy 어플리케이션 개발을 위해 IVT mRNA를 이용하였고, 합성 mRNA를 효율적으로 생성하기 위해 합성 프로토콜을 최적화하였다. 단일 벡터로부터 다수 단백질의 발현은 생체 의학 응용 분야에서 매우 매력적인 접근법이다. 다중 단백질의 동시 발현을 달성하기 위해, 2A 펩티드 서열을 multi-cistronic mRNA 시스템의 개발에 이용할 수 있다. IRES (Internal Ribosome Entry Site) 기반 다중 단백질 발현 시스템과 달리, 2A peptide는 높은 절단 효율을 가지며, 단일 벡터에서 다중 단백질들의 등가 발현 비율을 초래한다고 알려져 있다. 3 개의 별개의 형광 단백질을 (GFP, RFP, BFP) 단일 IVT mRNA를 사용하여 번역하였다. 2A peptide의 자가 절단 효과의 확인에도 불구하고, 하류 유전자의 발현은 충분하지 않았다. 여러 종류의 2A peptides의 효과를 관찰해보는 추가 연구가 필요하다. mRNA 기반 백신은 많은 관심을 받고 있으며, 가까운 시일 내에 치료제로 개발 될 것으로 예상된다. IVT mRNA는 생체 내 생물학적 유체와의 접촉으로 인해 전달에 한계가 있기 때문에, 제제 전략이 요구된다. 특히, 지질 나노 입자 (LNP) 로 제형화된 mRNA는 몇몇 감염성 질환 및 암 면역 요법에서 연구되고 있다. 여기서, 우리는 면역보조제를 함께 포뮬레이션시킨 LNP 제제를 개발했다. 우리는 Pam3라는 면역보조제가 우리 시스템에서 강력한 면역보조제일 수 있음을 확인했다. 하지만, 다양한 항원 또는 보조제에 대한 전반적인 면역반응의 보다 상세한 메커니즘을 확인하기 위한 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.