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Development of Recombinant Escherichia coli Strains for the Production of Butyrate

Title
Development of Recombinant Escherichia coli Strains for the Production of Butyrate
Authors
박수경
Issue Date
2020
Department/Major
대학원 화학신소재공학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
박시재
Abstract
부티레이트는 화장품, 음식, 연료 등 다양한 산업분야에서 활용되고 있는 4-탄소 지방산이다. 최근에는 부티레이트가 인체의 장내에서 면역반응에 기여한다는 사실이 새롭게 규명되었다. 따라서 부티레이트 생산 대장균은 제약산업에서의 플랫폼 미생물로서 활용가치가 높으며, 본 연구에서는 이를 위해 atypical E. coli를 숙주 균주로 사용하였다. atypical E. coli는 염증완화활성에 기여하는 장내미생물이며 해당 균주는 다양한 감염성 질환을 치료할 수 있는 잠재성을 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 다양한 산업분야에 쓰이는 부티레이트의 대량생산을 위한 부티레이트 생산 재조합 E. coli XL1-Blue 균주를 개발함과 동시에, 제약산업에서 활용 가능성이 높은 부티레이트 생산 재조합 atypical E. coli를 개발하였다. 본 연구에서는 먼저, 부티레이트 생산 유전자를 대장균에 도입할 수 있는 대사공학적 전략을 설계하였고, 해당 유전자를 이용하여 플라스미드를 제작하였다. 그 후, 제작한 플라스미드를 E. coli XL1-Blue 균주에 도입하여 부티레이트 생산균주로 형질전환하였다. 하지만 atypical E. coli의 형질전환 효율이 낮아 세 개의 플라스미드를 사용하는 전환방법은 사용이 제한되었고, 이를 해결하기 위해 플라스미드 개수를 두 개로 줄여 atEc 균주에 형질전환에 성공하였다. 그럼에도 불구하고, 재조합 atEc에서는 부티레이트를 생산할 수 없었다. 따라서 atEc의 크로모좀에서 부티레이트를 생산하기 위해 다양한 경쟁 대사회로 유전자를 선별하였고, Cre-lox system을 사용하여 해당 유전자들을 제거하였다. 부산물 생성유전자가 제거된 재조합 XL1-Blue 균주와 재조합 atEc 균주의 부티레이트 생산을 비교해본 결과, XL1-Blue 균주는 frdB (숙신산 생산 유전자) 제거 균주에서 1.72 g/L로 야생형 XL1-Blue 균주보다 높은 부티레이트 생산을 달성할 수 있었다. 게다가 atEc 균주에서는 ldhA (락테이트 생산 유전자) 제거 균주가 XL1-Blue 균주보다도 높은 2.27 g/L의 부티레이트를 생산하였다. 다음으로 인체에 부작용을 초래하는 항생제의 사용을 줄이고자 플라스미드로 발현했던 외래 유전자를 크로모좀에 삽입시키기 위한 실험이 수행되었다. 이를 통해 외래 유전자가 도입된 재조합 atEc 균주를 확보하였고, 차후 이들의 부티레이트 생산 여부를 확인하기 위한 추가적인 실험이 필요하다. 따라서 본 연구를 통해 다양한 부티레이트 생산 재조합 균주가 확보되었다. 재조합 XL1-Blue 균주는 화학물질로 사용될 수 있는 부티레이트의 대량생산을 위한 후보 균주로 이용될 수 있고, 재조합 atEc 균주는 높은 염증완화활성을 가질 것으로 예상되며, 이를 확인하기 위한 추가적인 균주 조작 및 임상 실험이 필요할 것으로 보여진다. 이를 통해 해당 재조합 균주가 염증성 장질환 및 감염성 질환 등을 치료할 수 있는 유용 균주로 활용될 수 있을 것으로 보여지며, 제약산업에서의 질병 치료를 위해 다양한 활용가능성을 보유할 것으로 기대된다. ;Butyrate is a 4-carbon fatty acid that is used in various industries such as cosmetics, food, and plastics. Recently, it has been found that butyrate contributes to an immune response in the intestines of the body. Two Escherichia coli as a host strains were used for the butyrate biosynthesis in this study. E. coli XL1-Blue (XL1-Blue) is a widely used strain for routine cloning, and atypical E. coli (atEc) is an intestinal microorganism that contributes to anti-inflammatory activity, which has the potential to treat a variety of infectious diseases. Therefore, butyrate-producing recombinant E. coli strains are highly applicable to the chemical industry as well as the pharmaceutical industry. In this study, a metabolic strategy was first designed based on butyrate-producing genes, and plasmids were constructed using those genes. The genes were then transformed into XL1-Blue strain to produce butyrate. However, recombinant atEc strain was unable to produce butyrate, in spite of reduced number of plasmids to deal with its low transformation efficiency of atEc. Thus, genes have been removed from various competitive pathway for the production of butyrate from the chromosomal DNA of XL1-Blue and atEc. As a result, butyrate production of two strains, XL1-Blue strains and atEc strains, from which the byproduct genes was removed was compared, and the XL1-Blue strain was able to achieve butyrate titer higher than the XL1-Blue wild type at 1.72 g/L in the frdB deletion strain. atEc strains produced butyrate of 2.27 g/L in the ldhA deletion strain, which was the highest titers among all strains. Therefore, a variety of the butyrate-producing recombinant strains have been obtained in this study. The recombinant XL1-Blue strain can be used as a candidate strain for mass production of butyrate as a chemical because it not only stably produced butyrate in wild-type strains but also increased butyrate production in further strain manipulation. In addition, recombinant atEc is expected to have a high anti-inflammatory activity, thereby increasing the applicability of the strain in the pharmaceutical industry.
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