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Engineering of Alcohol/Aldehyde Dehydrogenase-Based Whole-Cell Biocatalysts for Biosynthesis of Azelaic Acid

Title
Engineering of Alcohol/Aldehyde Dehydrogenase-Based Whole-Cell Biocatalysts for Biosynthesis of Azelaic Acid
Authors
이현주
Issue Date
2020
Department/Major
대학원 식품공학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
박진병
Abstract
1,9-Nonanedioic acid (i.e., azelaic acid) is used as a precursor for various products such as polyesters, polyamides, lubricants, coatings and cosmetics. For the production of azelaic acid, chemical methods have been used but due to environmental problems, biotransformations were examined. For instance, biotransformation pathway of renewable fatty acids (e.g., oleic acid) into azelaic acid has been reported. However, the final concentration of the target product was limited by toxic effect of the dicarboxylic acid to microbial cells. Thereby, this study will focus on the production of azelaic acid from 9-hydroxynonanoic acid, which had been produced by oleic acid by using alcohol/aldehyde dehydrogenase (ChnDE) from Acinetobacter sp. NCIMB 9871. Subsequently, several engineering strategies will be presented for the production of azelaic acid to high concentrations. As a first strategy, the potential of Corynebacterium glutamicum was examined as a host cell for the production of azelaic acid. C. glutamicum showed significant tolerance to azelaic acid compared to Escherichia coli. When the biotransformation of 20 mM 9-hydroxynonanoic acid was carried out by the recombinant C. glutamicum cell, azelaic acid was produced to a conversion of 80% within 8 h. However, the recombinant E. coli, expressing ChnDE, exhibited a conversion of 100% within 1 h. Therefore, further engineering for the azelaic acid production was carried out with E. coli strains. The next strategy was to express the NADH oxidase (NOX) derived from Lactobacillus brevis to supply the nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) cofactor required for ChnDE reactions. The biotransformation results of the simultaneous expression of ChnDE and NOX showed no significant difference in initial reaction rate and conversion, compared to that of ChnDE expressed alone. Another strategy is to use adsorbent resins to inhibit toxic effects of the reactants and products. As a result of converting 100 mM 9-hydroxynonanoic acid, the final product concentration of azelaic acid increased from 10 mM to 37 mM in the aqueous reaction medium by using adsorbent resin. Therefore, it was found that biosynthesis of target product to a high concentration is possible in the presence of resin. Moreover, biosynthesis of branched chain fatty acid (e.g., 3-methyl-2-butenoic acid) was proceeded in the presence of NOX and resin, resulting in enhanced biotransformation activity. In summary, this study found that among the three strategies, the use of resin yielded the highest concentrations of the final product. For further study, this strategy will contribute to enhance the final product concentration of variety of fatty acids.;1,9-Nonanedioic acid (Azelaic acid)는 폴리에스터, 폴리아마이드, 윤활제, 코팅제 및 화장품과 같이 다양한 분야의 전구체로 사용된다. 이러한 azelaic acid는 화학적인 기법으로 제조되어 왔지만, 환경문제로 인해 enzymatic cascade reaction을 이용한 연구가 활발히 진행되었다. 예를 들면, 재생가능한 지방산으로부터 (예를 들면, oleic acid) azelaic acid를 생산하는 생물전환 경로가 구축되었다. 그러나 표적 생성물의 최종 농도는 azelaic acid가 미생물에 미치는 독성 효과에 의해 제한되었다. 따라서, 본 연구는 Acinetobacter sp. NCIMB 9871 유래의 alcohol/aldehyde dehydrogenase를 이용하여 oleic acid로부터 만들어지는 9-hydroxynonanoic acid로부터 azelaic acid를 생산하는 경로에 중점을 둘 것이다. 이어서 azelaic acid를 고농도, 고수율로 생산하기 위해 여러 엔지니어링 전략을 제시하였다. 첫번째 전략으로 Corynebacterium glutamicum은 azelaic acid를 생산하기 위한 숙주세포로서 연구되었다. C. glutamicum은 Escherichia coli에 비해 azelaic acid에 대한 내산성이 강한 결과를 보였다. 재조합 C. glutamicum 균주로 20 mM의 9-hydroxynonanoic acid를 반응시킨 결과, 80%가 8시간 만에 azelaic acid로 전환된 것을 확인할 수 있었다. 하지만, ChnDE를 발현하는 재조합 E. coli는 1시간 내에 100%의 전환률을 보였다. 따라서, azelaic acid 생산을 위한 추가적인 엔지니어링은 E. coli 균주를 기반으로 진행되었다. 다음 전략은 Lactobacillus brevis 유래의 NADH oxidase (NOX)를 발현시켜 ChnD에 필요한 NAD+ 보조인자를 공급하는 방법이다. ChnDE와 NOX를 동시발현시킨 결과, 초기 반응 속도와 전환률에서 ChnDE를 단독 발현 시켰을 때의 생물전환 결과와 큰 차이를 보이지 않았다. 다른 전략은 흡착제 수지를 사용하여 기질과 생성물이 세포에 미치는 독성 효과를 저해시키는 방법이다. 100 mM 9-hydroxynonanoic acid의 생물 전환 결과, 수지를 사용한 경우 buffer 상에서 최종 생성물의 농도는 10 mM에서 37 mM로 증가하였다. 따라서 수지를 이용하여 고농도의 지방산 생합성이 가능하다는 것을 규명하였다. 나아가서, 재조합 E. coli 균주로 NOX와 수지의 존재 하에서 가지 달린 지방산 (예를 들면, 3-methyl-2-butenoic acid)의 생합성이 진행되었을 때, 수지를 이용한 경우 biotransformation activity가 증가하는 결과를 보였다. 정리하자면, 이 연구는 세 가지 전략 중에서 수지의 사용이 가장 높은 최종 생성물의 농도를 산출한다는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 향후 가지 달린 지방산과 선형 지방산을 포함한 다양한 생성물을 고농도로 생산하는 데 이러한 엔지니어링 전략들이 기여할 것으로 사료된다.
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