Gas6의 상피중간엽이행 억제 효과 및 작용 기전 연구

Abstract

The epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays physiologic roles in the embryogenesis, wound healing, and tissue regeneration. In terms of pathological direction, it causes organ fibrosis, cancer development, progression, metastasis, and chemoresistance. Transforming growth factor b (TGF-b) proteins regulate cell function, and have key roles in development and carcinogenesis. TGF-b1 is widely known as major inducer of EMT in development and fibrosis. TAM receptors (Tyro3, Axl, and Mer) belong to a family of receptor tyrosine kinase that have important effects on hemostasis and inflammation. Also, they affect cell proliferation, survival, adhesion, and migration. TAM receptors can be activated by the vitamin K–dependent proteins growth arrest-specific protein 6 (Gas6) and protein S. The precise mechanism of the EMT suppression effect of Gas6 has still unknown. I investigated a role of Gas6 and its underlying mechanisms in prevention EMT process in murine AT Ⅱ-like lung epithelial cells (LA-4 cells), Kidney epithelial cells (HEK-293 cells) and Primary mouse alveolar-epithelial type Ⅱ cells. TGF-b1 exposed LA-4 cells for 2-3 days caused EMT, during which cells acquired a spindle- like morphology. In addition, E-cadherin expression known as adherens junction protein was decreased, while the expression of N-cadherin and α-SMA, a marker of myofibroblast differentiation, was up-regulated. Also induction of EMT-activating transcription factor, such as Snail1/2, Zeb1/2, and Twist1. In addition, induced EMT- activating transcription factor, such as Snail1/2, Zeb1/2, and Twist1. Pretreatment with Gas6 inhibited TGF-β1-induced EMT process in LA-4 cells. This result confirmed change of morphologic and EMT marker expression both in the protein and mRNA level. Gas6 inhibited TGF-β1-induced mRNA expression of Snai1/2, Zeb1/2 and Twist1 in LA-4 cells. furthermore, it has been demonstrated that biological mediators in the Gas6 antagonize TGF-b1 signaling by partially blocking intracellular Smed-independent signaling pathways, such as p-ERK and p-Akt pathways, but not Smed-dependent signaling pathways. These data explain that down-regulation of Smed-independent signaling lead to the inactivation of transcription factor that bind to Snai1/2, Zeb1/2 and Twist1 promoters. I confirmed Gas6 plays a potential role in resistance to induction of EMT via the production of potent autocrine EMT inhibitors. The cyclooxygenase-2 (COX-2)-derived prostaglandin E2 (PGE2) and prostaglandin D2 (PGD2) pathways are potent EMT inhibitors in lung and kidney epithelial cells. I investigated whether COX-2-derived PGE2 and PGD2, secreted from LA-4 cells in response to Gas6, mediate anti-EMT effects in LA-4 cells as autocrine. Gas6 increased COX-2 expression and PGE2 and PGD2 secretion as well as their receptors, such as EP2 and DP2. Additionally, exposure of LA-4 cells to COX-2 specific siRNA and inhibitors of COX-2, EP2, or DP2 reversed TGF-b1-induced EMT inhibition by Gas6, including indicate spindlle-like cellular morphology and loss of E-cadherin, synthesis of α-SMA and N-cadherin at the mRNA and protein level, and Snai1, Zeb1 and Twist1 mRNA expression up-regulated in LA-4 cells. Exposure of LA-4 cells to COX-2 specific siRNA decreased COX-2 expression, PGE2 and PGD2 secretion. Through confirmed that anti-EMT effects were mediated by COX-2-derived PGE2 and PGD2 signaling, primarily through the EP2 and DP2 receptors in LA-4 cells. According to other studies, EMT involved in fibrotic remodeling in alveolar epithelial cells is inhibited by Hepatocyte growth factor (HGF). Therefore, it has been investigated the role of RhoA/Rho kinase pathway-dependent HGF secretion from LA-4 cells exposed to Gas6 in anti-EMT effects. Gas6 increased RhoA/Rho kinase pathway-dependent HGF secretion as well as their receptors, such as c-Met. Additionally, using the RhoA specific siRNA and RhoA/Rho kinase inhibitor, c-Met inhibitor in LA-4 cell reversed TGF-b1-induced EMT inhibition by Gas6, including indicate spindlle-like cellular morphology and reducing E-cadherin loss, synthesis of α-SMA and N-cadherin at the mRNA and protein level, and Snai1, Zeb1 and Twist1 mRNA expression up-regulated in LA-4 cells. I confirmed RhoA/Rho kinase pathway-dependent HGF secreted from LA-4 cells in response to Gas6, mediate anti-EMT effects in LA-4 cells. To confirm that PGE2, PGD2 and HGF act in a paracrine manner to induce the anti-EMT effects, it has been investigated the effect of these soluble mediators at basal and stimulation concentrations on LA-4 cells. Through this study confirm that EMT inhibition in LA-4 cells was at least partially aroused by Gas6 induced release of PGE2, PGD2 and HGF. ;상피중간엽이행(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)은 세포의 표현형이 전환되는 과정을 의미한다. 접착단백질이 존재하고 극성을 유지하고 있는 상피세포의 세포모양이 정방형에서 섬유아세포로 바뀌며 상피세포 표지인자가 감소하고, 극성을 잃고 이동성이 높아지며 중간엽 세포 표지인자가 증가하며 침투 표현형을 지닌 중간엽 세포로 전환 된다. 폐포 상피세포에서 Transforming growth factor-b1 (TGF-b1)의 증가는 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)이 증가하여 폐 섬유화 유도와 EMT 발생에 관여한다. Growth arrest-specific protein 6 (Gas6)는 TAM (Tyro3, Axl, Mer) 수용체와 결합을 이루며, 이러한 수용체는 사멸세포 포식 작용 향상에 관여한다. Gas6는 섬유화를 촉진하는 물질로 EMT를 유도한다고 알려져 왔으나, 최근 보고에서는 Gas6가 구강내 면역반응을 억제하여 구강 점막 상피세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 하지만 아직까지 상피세포에서의 Gas6의 항상성 조절 작용에 대한 연구 보고가 많지 않으며, 상피세포에서 Gas6의 항 EMT에 관여하는지에 대한 연구가 발표된 바 없다. 본 연구에서는 TGF-b1에 의해 유도된 EMT조건에서 Gas6에 의한 EMT억제 작용과 조절기전을 규명하고자 하였다. 본 연구에서는 폐포 type Ⅱ-유사 상피세포(LA-4 cells), 신장 상피세포(HEK-293 cells), 그리고 일차 마우스 폐포 type Ⅱ 세포(Primary mouse alveolar-epithelial type Ⅱ cells)에서 TGF-b1에 의해 유도되는 EMT의 표지인자 E-cadherin의 발현 감소, N-cadherin과 α-smooth muscle actin (SMA)의 발현 증가가 Gas6를 통해 억제됨을 mRNA와 단백질 수준에서 확인하였다. 뿐만 아니라 TGF-b1에 의해 유도되는 Snai1/2, Zeb1/2, 그리고 Twist1의 mRNA발현의 증가가 Gas6 처리 후 억제되었다. 기존 연구에서, ERK와 PI3K/Akt 신호 전달기전은 Gas6-TAM receptor tyrosine kinase의 활성화에 의하여 유도되는 대표적인 신호전달 기전으로 알려져 있으나, Gas6에 작용하는 신호경로 확인 연구에서는 Gas6가 ERK1/2, Akt 신호전달 경로와 같은 Smad-비의존적인 TGF-b1 신호전달 경로를 부분적으로 차단함으로써 TGF-b1 신호전달 경로를 억제하며, Smad-의존적인 TGF-b1 신호전달 경로에는 작용하지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 Smad-비의존적인 TGF-b1 신호전달 경로에 의해 Snai1/2, Zeb1/2, Twist1과 같은 EMT 조절 전사인자의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며, 이러한 신호전달 경로를 통해 Gas6에 의한 TGF-b1에 유도되는 EMT 억제효과를 나타냈다. Gas6의 처리 후 Cyclooxygenase-2 (COX-2)와 Hepatocyte growth factor (HGF)발현이 증가하는 것을 mRNA수준과 단백질 수준에서 확인하였으며, ELISA를 통해 HGF와 ProstaglandinE2 (PGE2), ProstaglandinD2 (PGD2)의 생성이 증가하는 것을 확인하였다. COX-2 siRNA와 COX-2 억제제 또는 RhoA siRNA와 RhoA kinase 억제제를 처리하거나 PGE2, PGD2의 수용체 EP2와 DP2 길항제 처리군과 c-Met 길항제를 각각 처리하여 Gas6에 의해 억제 되었던 EMT 표지인자의 변화가 E-cadherin의 발현 감소, N-cadherin과 α-smooth muscle actin (SMA)의 발현 증가됨으로 EMT가 다시 진행되었으며, ERK1/2, Akt의 인산화에 대한 Gas6의 억제효과가 반전되어 Snai1/2, Zeb1/2, Twist1와 같은 EMT 조절 전사인자의 발현이 증가하였다. ELISA를 통해 얻은 PGE2와 PGD2, HGF의 농도만큼 처리하였을 때 높은 농도의 PGE2, PGD2와 HGF의 분비량이 EMT를 억제하는 것을 확인하였다. Gas6를 의한 EMT 억제효과에 대해 해당 수용체의 발현과 관여하는지에 대해 HGF의 수용체인 c-Met과 PGE2,의 수용체인 EP2와 PGD2,의 수용체인 DP2의 단백질 발현의 증가를 확인하였다. 결과적으로 본 연구는 Gas6의 자극을 통해 COX-2-유도 PGE2와 PGD2의 생성과, Rho/RhoA Kinase 경로 의존적인 HGF의 분비가 Gas6에 의한 항 EMT효과를 이끌어내며 또한 PGE2, PGD2와 HGF의 수용체인 EP2, DP2, c-Met의 발현을 증가시켜 EMT 억제 효과에 관련이 있음을 의미한다. Gas6의 작용을 바탕으로 폐 섬유화뿐 아니라 EMT로 인한 질병에 대해 새로운 치료 전략 개발에 기여할 것으로 기대한다.