MicroRNAs and long non-coding RNAs regulating lung tumorigenesis and metastasis

Abstract

전체 암 중 폐암은 남성과 여성 모두에서 사망률이 제일 높으며, 대부분의 폐암 환자는 전이가 일어난 상태에서 진단 받기 때문에 예후가 좋지 않다. 폐암 환자를 성공적으로 치료하기 위해서는 전이에 대한 깊은 이해가 필요하다. 이를 위해 이 학위 논문에서는 폐암의 전이를 조절하는 non-coding RNA (miRNA와 long non-coding RNA)의 역할과 기능을 알아보고자 한다. miR-200은 폐암 세포를 포함한 다양한 상피 암세포의 상피간엽이행(EMT)을 억제한다고 알려져 있다. 이 학위 논문의 첫번째 파트에서는 microarray profiling을 통해서 cytokine 및 chemokine과 연관된 유전자들이 miR-200에 의해 조절된다는 것을 알았으며, 그들 중 miR-200에 의해 발현이 감소하는 BMP4 유전자를 선택하여 폐암에서의 BMP4의 조절 기작과 역할에 대해 조사하였다. 프로모터 및 3´-UTR luciferase reporter assay를 수행한 결과, miR-200은 BMP4의 전사인자인 GATA4/6를 억제함으로써 BMP4의 발현을 간접적으로 감소시킨다는 것을 밝혔다. 그리고 BMP4의 발현 억제는 암세포의 성장, 이동 및 침투를 억제시킬 뿐만 아니라 동형유전자형 생쥐 모델에서도 암생성과 전이를 억제시켰다. 3-D Matrigel™ culture에서 BMP4의 발현 억제는 비정상적인 acini 형성을 초래했는데, 이것은 BMP4가 세포 극성 유지에 필수적이라는 것을 의미한다. 게다가 BMP4는 JAG2/Notch-GATA3 신호전달계를 활성화시켜서 miR-200을 억제한다는 것을 밝혔다. 이러한 신호 전달 기작을 통해서 BMP4는 폐암 종양 형성을 촉진하는데, 이는 BMP4와 그 저해제가 폐암 환자에게 좋은 치료 전략이 될 수 있다는 것을 시사한다. 두번째 파트에서는 암 억제자로 잘 알려져있는 miR-34 family member의 역할에 대해 폐암 세포 및 동물 모델에서 연구하였다. MiR-34 family member에는 miR-34a, miR-34b, 그리고 miR-34c가 있는데 miR-34a와 miR-34b/c는 서로 다른 두 염색체 상에 위치한다. 이들은 동일한 seed sequence를 가져 같은 유전자들을 타겟할 것이라 예상되지만 폐암 환자 TCGA 데이터를 분석한 결과, miR-34a와 miR-34c는 서로 다른 유전자를 타겟할 것으로 예측되었다. 이것은 miR-34a와 miR-34b/c가 폐암에 서로 다른 효과를 보일 수 있다는 것을 의미한다. 이것을 증명하기 위해, miR-34a와 miR-34b/c를 마우스 폐암 세포에서 각각 과발현 시키고 이들을 이용해 세포 기반 실험들을 진행하였다. 그 결과, miR-34b/c는 miR-34a보다 세포의 성장과 침윤 그리고 암 성장을 더 효과적으로 억제했다. 이 결과들은 miR-34b와 miR-34c가 miR-34a보다 더 강한 암 억제자라는 것을 의미한다. 그리고 폐암 마우스 모델에서, miR-34a/b/c 발현을 모두 없애면 돌연변이 Kras에 의한 폐암 진행을 더욱 촉진시켰다. 또한, 폐암 환자 TCGA 데이터에서 miR-34a/b/c의 발현이 높은 환자 그룹은 낮은 그룹보다 생존률이 더 높았다. 따라서, miR-34 family members의 조합은 효과적인 항암 치료 전략이 될 수 있을 것이다. 수많은 lncRNA들이 암과 정상조직에서 차별적인 발현을 보이며 암 발생에서도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 세번째 파트에서는 폐암에서 ZEB1과 EMT에 의해 조절되는 long non-coding RNA (lncRNA)를 찾기 위해 ZEB1 과발현 마우스 폐암 세포에서 lncRNA sequencing을 실시하였다. 이를 통해 ZEB1에 의해 발현이 증가하는 lnc-Nr2f1을 선택하여 연구를 진행하였다. Lnc-Nr2f1은 EMT 유도 인자인 TGF-β에 의해서 증가하였으며, EMT와도 관련성을 보였다. 또한 lnc-Nr2f1을 억제하면 폐암 세포의 성장, 이동 및 침윤이 감소되었다. 이는 ZEB1과 EMT에 의해 조절되는 lnc-Nr2f1이 폐암의 진행을 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 결론적으로 종합하면 이 학위 논문에서는 ZEB1과 EMT에 의해 조절되는 miRNA와 lncRNA가 다양한 기능적 조절 기작을 통해 폐암 생성 및 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 증명하였다.;Lung cancer is the most common cause of cancer-related death in men and women. Majority of lung cancer patients are diagnosed with metastasis, and their prognoses are very poor. For successful treatment of lung cancer patients, deep understandings about metastatic diseases are necessary. Therefore, in this thesis, the roles and functions of non-coding RNAs (miRNAs and long non-coding RNAs) regulating lung metastasis were investigated. MiR-200 is known to inhibit epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of various epithelial cancer cells, including lung cancer cells. Previously, through microarray profiling, the genes related to cytokines and chemokines were identified to be regulated by miR-200. Among them, the expression of BMP4 decreased in miR-200-overexpressing cells and in epithelial-like cancer cells. In the first part of this thesis, the regulatory mechanisms and the roles of BMP4 depleted by miR-200 were investigated. To examine the regulatory mechanisms of BMP4 by miR-200, promoter and 3´-untranslated region (3´-UTR) luciferase reporter assays were conducted. MiR-200 directly suppressed GATA4 and GATA6 transcription factors by binding to their 3´-UTRs, and GATA4 and GATA6 increased the BMP4 promoter activity, suggesting that miR-200 down-regulated BMP4 by directly targeting GATA4/6 transcription factors. Functionally, BMP4 knockdown inhibited cancer cells growth, migration, and invasion, and also repressed lung tumorigenesis and metastasis in a syngeneic mouse model. In 3-D Matrigel™ culture, BMP4 knockdown caused abnormal acini formation of cancer cell spheres, implying that BMP4 is essential for cell polarity maintenance. In addition, BMP4 up-regulated JAG2/Notch signaling which suppressed miR-200 by activating GATA3. Thus, BMP4, JAG2/Notch, GATA3, miR-200 and GATA4/6 form a regulatory loop. Collectively, BMP4 acts as a pro-tumorigenic factor in lung cancer; therefore, BMP4 and its antagonists would be good therapeutic targets to treat lung cancer patients. In the second part, the roles of miR-34 family members which are known as tumor suppressive miRNAs were investigated in lung cancer cells. Three miR-34 family members (miR-34a, miR-34b, and miR-34c) are clustered on two different chromosomal loci, that is, Mir34a and Mir34b/c. These miRNAs have identical seed sequences and thus are predicted to share a common set of target genes. However, miR-34a and miR-34c have different sets of negatively correlated genes in lung adenocarcinoma data from The Cancer Genome Atlas (TCGA), implying that miR-34a and miR-34b/c may have different effects on lung cancer cells. To prove this, miR-34a and miR-34b/c were separately overexpressed in mouse lung cancer cells. As a result, miR-34b/c showed more potent inhibitory effects on cell growth and invasion than miR-34a. Both miR-34a and miR-34b/c suppressed mouse lung metastasis; however, miR-34b/c repressed tumor growth more than miR-34a. In addition, miR-34b/c-overexpressing cells expressed less mesenchymal markers (Fn1 and Cdh2) and more epithelial markers (Cldn3, Dsp, and miR-200) than miR-34a-overexpressing cells. These results imply that miR-34b and miR-34c are stronger EMT suppressors than miR-34a. Moreover, in a lung cancer mouse model, knockout of all three miR-34 members further promoted mutant Kras-driven lung tumor progression. In lung adenocarcinoma data from TCGA, the survival rates were greater in patients with higher miR-34a/b/c levels than those with lower levels. On the basis of these findings, it is suggested that the combination of all three miR-34 family members would be an effective anti-cancer therapeutic strategy. In the third part, long non-coding RNAs (lncRNAs) regulated by ZEB1 and EMT were studied in lung cancer. Numerous lncRNAs show differential expression between cancer and normal tissues and play important roles in cancer development. To identify novel lncRNAs regulated by ZEB1 and EMT, lncRNA sequencing was performed in ZEB1-overexpressing mouse lung cancer cells. Through this lncRNA profiling, lnc-Nr2f1 was selected, which was highly induced by ZEB1. Lnc-Nr2f1 correlated positively with ZEB1 in mouse lung cancer cells and in lung adenocarcinoma TCGA data. Lnc-Nr2f1 also increased when EMT was induced by TGF-β treatment, and positively correlated with the EMT score in TCGA data. Moreover, lnc-Nr2f1 knockdown inhibited cell growth, migration, and invasion of lung cancer cells. Consequently, lnc-Nr2f1 is up-regulated by ZEB1 and EMT, and promotes lung cancer progression. Overall, in this thesis, it was elucidated that miRNAs and lncRNAs regulated by ZEB1 and EMT play important roles in lung tumorigenesis and metastasis through diverse functional mechanisms.