Studies of the roles of NADPH oxidase in testosterone-mediated apoptosis of hair follicle cells

Abstract

남성 호르몬인 테스토스테론은 모발 성장 주기를 단축시키고 남성형 탈모증을 유발한다. 테스토스테론이 nuclear receptor에 결합하여 모발 주기와 관련된 타깃 유전자들의 발현을 조절하는 기작은 잘 알려져 있다. 하지만 테스토스테론은 또한 세포 표면에 위치한 GPRC6A의 활성화를 통해 세포 내 칼슘의 농도를 조절하여 빠르고 일시적인 non-classical action을 유도할 수 있다. GPRC6A를 통한 테스토스테론의 칼슘 조절 기능을 확인하고자 본 연구에서는 Gprc6a knockout 마우스를 제작하였다. 그 결과 Gprc6a가 결핍된 keratinocyte는 테스토스테론 자극에도 세포 내 칼슘 유입을 조절하지 못하는 것을 확인할 수 있었다. 활성 산소를 생성하는 효소인 NADPH oxidase (NOX) 중 DUOX1은 keratinocyte와 outer root sheath (ORS) 세포에서 가장 주요하게 발현되는 isozyme이며 칼슘에 의해 활성화 된다. 따라서 테스토스테론 자극에 의한 H2O2 의 생성을 Duox1을 knockout 시킨 keratinocyte에서 측정하였고, 그 결과 H2O2의 생성에 실패하는 것을 확인하였다. 다음으로 테스토스테론에 의해 모낭 세포들의 세포 사멸이 유도되며 이것은 탈모로 이어진다는 사실이 잘 알려져 있기 때문에 우리는 테스토스테론에 의한 Gprc6a KO와 Duox1 KO keratinocyte의 세포 사멸을 확인해 보았다. 테스토스테론에 의해 야기된 keratinocyte의 세포 사멸이 Gprc6a와 Duox1 결핍 시에는 억제 되는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 testosterone-GPRC6A-DUOX1 axis가 keratinocyte에서 활성 산소의 생성을 매개하고 세포 사멸을 유도한다는 것을 알 수 있다. 남성형 탈모증은 테스토스테론이 모낭의 성장기 (anagen)를 단축시키면서 일어난다. 테스토스테론이 모발의 성장기에서 퇴행기로 넘어가는 과정 (anagen-to-catagen transition)을 촉진하는 것이 성장기 단축의 핵심이다. 본 연구에서는 testosterone-GPRC6A-DUOX1 axis가 이러한 성장기-퇴행기 진행과정을 조절하여 성장기의 단축에 관여할 것이라고 가정하였다. 이를 밝히고자 wild-type과 Gprc6a KO, Duox1 KO 마우스에서 어떠한 자극이 없는 자연적인 모발 주기를 확인하였다. 그 결과 wild-type 마우스에 비해 Gprc6a KO과 Duox1 KO 마우스에서 성장기가 길게 유지되는 것을 모발의 길이를 측정함으로써 확인할 수 있었다. 성장기의 지표인 Ki-67의 발현을 면역 형광법을 통해 비교하였을 때에도 Ki-67이 염색된 세포가 wild-type에 비해 Gprc6a KO과 Duox1 KO의 모낭에서 많이 관찰되었다. 남성형 탈모증에서 testosterone-GPRC6A-DUOX1 신호 네트워크의 역할을 확인하고자 생후 31일째의 wild-type과 Gprc6a KO, Duox1 KO 마우스의 등 쪽 피부에 국소적으로 테스토스테론을 일주일간 도포하고 모발의 상태를 관찰하였다. 테스토스테론을 처리한 wild-type 마우스는 모낭의 길이가 짧아지고 퇴행기로 넘어감에 반해 Gprc6a KO과 Duox1 KO 마우스의 모낭은 테스토스테론의 이런 작용에 저항성을 보였다. 따라서 GPRC6A와 DUOX1이 테스토스테론의 모발 주기 조절 작용에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 이러한 연구 결과에 따라 본 연구에서는 남성형 탈모증의 치료를 위한 NOX 억제제를 개발하고자 하였다. 이를 위해 천연물 라이브러리를 이용하여 high throughput screening (HTS)을 진행하였고, 큰고량강 (Alpinia galanga)에서 유래된 1's-1'-Acetoxychavicol acetate (EWHA-2729)가 pan-NOX 억제제로써 작용함을 밝혔다. EWHA-2729는 hNOX1에서 84.0 μM, hNOX2에서 23.3 μM, hNOX4에서 44.3 μM, hDUOX1에서 36.4 μM의 IC 50 값을 보였고 이는 기존에 보고된 NOX 억제제인 EWHA-18278 (APX-115) 보다 높은 값이다. 그러나 EWHA-2729를 전 처리한 keratinocyte에서 테스토스테론에 의한 활성산소의 생성과 세포 사멸 작용이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 EWHA-2729을 C57BL/6의 등 피부에 국소적으로 처리하였을 때 테스토스테론에 의한 탈모 효과를 예방하였다. 결과를 종합하여 보면, 이 논문에서는 테스토스테론이 GPRC6A와 DUOX1의 활성화를 조절하여 모낭 세포의 생리를 조절한다는 것을 밝혔고, 이러한 기작을 바탕으로 NOX 억제제인 EWHA-2729를 개발하여 탈모 치료제로서의 가능성을 제시하였다. ;It has been well established that testosterone stimulates miniature of hair cycle, leading to androgenetic alopecia. Although testosterone binds to nuclear receptor and the complex regulates expression of hair cycle-related genes, non-classical action of testosterone induces rapid intracellular Ca2+ ([Ca2+]i) mobilization through the activation of GPRC6A localizing cell surface. To validate the function of GPRC6A in [Ca2+]i mobilization, we established Gprc6a KO mice. Stimulation of Gprc6a-deficient keratinocytes with testosterone resulted in suppressed [Ca2+]i mobilization. DUOX1 isozyme is mainly expressed in keratinocytes and outer root sheath (ORS) cells and is regulated by [Ca2+]i mobilization. We measured testosterone-dependent H2O2 generation in Duox1 KO keratinocytes. Duox1-deficient keratinocytes failed to induce the H2O2 generation in response to testosterone. It has been well established that testosterone stimulates cell death of hair follicle cells leading to hair loss. We investigated whether testosterone regulates cell death in Gprc6a KO and Duox1 KO keratinocytes. Testosterone-dependent apoptosis in Gprc6a KO and Duox1 KO keratinocytes was suppressed, indicating that testosterone-GPRC6A-DUOX1 axis regulates reactive oxygen species (ROS) generation and apoptosis in keratinocytes. Androgenetic alopecia (male pattern hair loss) is induced by testosterone-mediated miniaturization of anagen phase in hair follicle cells. Stimulation of anagen-to-catagen transition plays an important role in the miniaturization of anagen phase. I hypothesized that testosterone-GPRC6A-DUOX1 axis regulates anagen-to-catagen transition, leading to the miniaturization of anagen phase. To verify my hypothesis, we measured natural hair cycle in wild-type (WT), Gprc6a KO and Duox1 KO mice. Anagen phase and hair lengths in Gprc6a KO and Duox1 KO mice were longer than that of WT. The expression of Ki-67 molecule as a hallmark of anagen phase in Gprc6a KO and Duox1 KO mice was higher than that of WT. To validate the function of testosterone-GPRC6A-DUOX1 signaling network in androgenetic alopecia, the back skins of WT, Duox1 KO and Gprc6a KO mice on postnatal day 31 were topically applied with testosterone for a week. Hair loss in Duox1 KO and Gprc6a KO mice were resistant from testosterone application, compared to WT, suggesting that GPRC6A-DUOX1 axis play a role in natural hair cycles and testosterone-mediated hair loss. Based on my observations, I extended my work the development of NADPH oxidase (NOX) inhibitor for the treatment of male hair loss. I performed high throughput screening (HTS) with natural products library. I found that 1's-1'-Acetoxychavicol acetate (EWHA-2729) was effective pan-NOX inhibitor and originally identified from Alpinia galanga. IC 50 values of EWHA-2729 on NOX isozymes were higher than chemical compound previously reported (EWHA-18278, APX-115). The values were 84.0 μM in hNOX1, 23.3 μM in hNOX2, 44.3 μM in hNOX4, and 36.4 μM in hDUOX1. However, the pre-treatment of EWHA-2729 showed the inhibition of testosterone-dependent H2O2 generation and apoptosis of keratinocytes. Moreover, topically application of EWHA-2729 in back skins of C57BL/6 resulted in the protection of testosterone-induced hair loss. Taken together, I present a molecular mechanism in which testosterone regulates GPRC6A and DUOX1 activation in hair follicle cells. I identify that NOX inhibitor (EWHA-2729) will be good therapeutic candidate for male hair loss treatment.